基于单剂量重组 VSV 的疫苗可引发针对汉坦病毒的强大且持久的中和抗体

细胞、病毒和抗体

小仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾上皮细胞（Vero E6）、人非小细胞肺癌细胞（A549）、人肝癌细胞（Huh7）和人宫颈癌（HeLa）细胞保存在含有 10% 胎牛血清 (FBS)（YEASEN，上海，中国）和 1% 青霉素-链霉素-庆大霉素溶液（Solarbio，北京，中国）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（康宁，纽约，美国）中。 HUVEC 维持在内皮细胞培养基 (ECM) (ScienCell, CA, USA) 中。所有细胞均保存在补充有 5% CO2 的 37°C 湿润培养箱中。 HTNV（菌株76-118）和SEOV（菌株SR-11）保存在我们的实验室。

如上所述，我们的实验室生产了针对 HTNV NP 的小鼠单克隆抗体 (mAb) 1A8、针对 HTNV Gn 的 mAb Gn-1 和针对 HTNV Gc 的 mAb Gc-1042。抗 VSV-G 标签购自 abcam（英国剑桥）。红外 (IR)Dye680RD 缀合的山羊抗小鼠和抗兔二抗购自 Lambda Instruments Corporation (LI-COR) Biosciences（LI-COR，NE，美国）。 Cyanine3 (Cy3)-缀合的山羊抗兔 IgG、山羊抗小鼠 IgG、异硫氰酸荧光素 (FITC)-缀合的山羊抗小鼠 IgG 和辣根过氧化物酶 (HRP)-缀合的抗小鼠 IgG 购自 Biotech & Bio Basic Inc.（BBI）（生工生物科技）。 Hoechst 33258 染色剂购自 YEASEN。

用于流式细胞术分析的单克隆抗体、eFluor 506-CD3、FITC-CD4、藻红蛋白 (PE)-IL-4、PE-Cyanine7-CD8a、别藻蓝蛋白 (APC)-IFNγ、多甲素-叶绿素-蛋白 (PerCP)-eFluo 710 -TNFα和Fixable Viability Dye eFluo 780有机染料(FVD-780)均获自eBioscience (马萨诸塞州，美国)。

重组 VSV 回收和滴定

缺少 VSV-G ORF 但带有额外 GFP ORF 的质粒 VSV 反基因组是在 GenScript（中国南京）合成的。 rVSV 和 rVSV-HTNV-GP 的生成和生产如前所述进行43。通过用 HTNV GP 替换内源 VSV-G 并在 HTNV GP 和 VSV-L ORF 之间添加荧光标记 (GFP)，设计了 VSV 的感染性 cDNA 克隆。为了促进 rVSV 救援，HTNV Gc 细胞质尾部的内质网 (ER) 保留序列被截断，以改变 HTNV GP 重新定位到质膜而不是 ER-高尔基体中间室 (ERGIC)44。为了进一步提高救援效率，我们将亮氨酸 532 突变为赖氨酸 (I532K)，将丝氨酸 1094 突变为亮氨酸 (S1094L)。 S1094L 位于病毒近膜外部区域 (MPER) 内，这会增加 Gc MPER 的两亲性特征（指定为 rVSV-HTNV-GP）45,46。对于rVSV-HTNV-GP，使用PCR扩增密码子优化的HTNV GPC基因(NC_005219)并将其插入VSV反基因组质粒中，产生rVSV-HTNV-GP载体。 BHK-21细胞接种带有T7 RNA聚合酶（VV-T7）的痘苗病毒（由中科院武汉病毒研究所友情提供），然后共转染五个质粒：全长rVSV-HTNV-GP，一起带有编码 VSV-N、VSV-P、VSV-L 和 VSV-G 蛋白的 VSV 辅助质粒，所有这些蛋白均受 T7 启动子控制。转染后72小时收集培养物上清液并用于感染Vero E6细胞。按照既定方案回收构建体15,47。传代数次后，单层细胞中的细胞病变效应（CPE）明显，表明拯救成功。拯救的病毒被称为rVSV-HTNV-GP，并通过HTNV GPC特异性抗体进行验证。

病毒在 Vero E6 细胞上繁殖和滴定，并使用噬菌斑测定法测定滴度。简而言之，将 Vero E6 细胞接种到 12 孔板中并生长过夜，直至细胞汇合度超过 90%。 rVSV 和 rVSV-HTNV-GP 原液连续稀释 10 倍，用于以每孔 500 μL 的浓度感染 Vero E6 细胞，一式三份。 37°C 孵育 2 小时后，吸出上清液，并向每孔添加 2 mL 补充有 2% FBS 和 2% 羧甲基纤维素 (CMC) 的维持覆盖 DMEM。然后将板孵育所需时间（rVSV 为 3 天，rVSV-HTNV-GP 为 7 天）。吸出覆盖培养基，并用结晶紫染色液（Beyotime，上海，中国）在室温下将细胞染色30分钟。计数每孔中的噬菌斑数量并计算rVSV和rVSV-HTNV-GP的效价。

rVSV 的生长动力学

用 rVSV 或 rVSV-HTNV-GP 以 0.0001 的感染复数 (MOI) 感染 6 孔板中 90% 汇合的 Vero E6 细胞，一式三份。 37℃孵育2小时后，洗涤板3次，并用补充有2％FBS的DMEM更换培养基，并在37℃、5％CO2下培养。在感染后0、12、24、48、60和72小时(hpi)从每个孔收集培养物上清液，并进行TCID50分析。简而言之，将每种上清液的十倍系列稀释液一式四份添加到 96 孔板中。去除病毒后，添加维持覆盖培养基。 7 dpi时，丢弃粘性覆盖培养基，用结晶紫溶液对细胞进行染色，然后使用Reed-and-Muench方法计算TCID50值。

病毒纯化和透射电镜

rVSV 和 rVSV-HTNV-GP 在 Vero E6 细胞中增殖。收获培养物上清液并通过在 4°C 下以 5000 × g 离心 30 分钟来澄清。然后将上清液与四倍体积的 0.8 M 氯化钠缓冲液 5 × 聚乙二醇 (PEG) 8000（Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国）混合浓缩，并在 4 °C 下孵育过夜，然后以 10,000 × 离心。 g 在 4°C 下保持 1 小时。然后将沉淀重新悬浮在 1 mL Tris-HCl（Tris-HCl：0.5 mM Tris-HCl、1.5 mM NaCl、0.05 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) 和 H2O 1 mL）中，4°C 过夜。

然后将重悬的溶液加载到碘克沙醇（Sigma-Aldrich）密度梯度介质上，该介质是通过将 4.2 mL 15% 碘克沙醇溶液铺在 3.8 mL 35% 碘克沙醇溶液上而形成的。使用 SW41 Ti 转子（Beckman Coulter，Brea，USA）在 4°C 下以 160,000 × g 超速离心 2 小时，对病毒进行显带。纯化的病毒粘附在发光的碳涂层铜网上。样品用 4% (w/v) 磷钨酸 (pH 7.1) 染色，并在 JEM-1400 Flash 透射电子显微镜（JEOL，日本）下观察。

SDS-PAGE 和蛋白质印迹

将纯化的 rVSV 和 rVSV-HTNV-GP 与 4 × 十二烷基硫酸锂 (LDS) 采样缓冲液 (GenScript) 混合，并在 100 °C 下煮沸 10 分钟。使用 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝 G-250 (YEASEN) 染色检查病毒蛋白。对于蛋白质印迹，分离病毒蛋白并转移到聚偏二氟乙烯膜上，并与小鼠抗 Gn-1 (1:100)、小鼠抗 Gc-10 (1:1000) 或兔抗VSV-G (1:2000, abcam, 309106) 抗体在含有 1% Tween-20 (TBST) 的 Tris 缓冲盐水中稀释，然后与 IRDye 680RD 山羊抗小鼠 (1:10000, LI-COR, 926- 68070) 或 IRDye 680RD 山羊抗兔 (1:10000, LI-COR, 926-32211)，并使用 Odyssey 成像仪 (LI-COR) 成像。

免疫荧光测定

Vero E6 细胞接种于 24 孔板中并在 37°C 下孵育过夜。使用HTNV、rVSV或rVSV-HTNV-GP感染细胞2小时，然后将培养基更换为含有2%FBS的DMEM并再培养48小时。细胞用 4% 多聚甲醛 (PFA) 在室温下固定 15 分钟，用 0.5% Triton X-100 透化 10 分钟，并用 1A8 (HTNV NP) (1:1000)、抗 Gn-1 (1) 染色。 :50)、抗 Gc-10 (1:100) 或抗 VSV-G (1:1000, abcam, 309106) 抗体，4°C 过夜。洗涤后，将Cy3标记的羊抗小鼠IgG（1：400，Sangon Biotech，D111024）或Cy3标记的羊抗兔IgG（1：400，Sangon Biotech，D111018）添加到每个孔中并在室温下孵育1小时。使用 Hoechst 33258（1:1000、YEASEN、40729ES10）对细胞核进行可视化。使用 BX60 荧光细胞成像仪（奥林巴斯，东京，日本）捕获图像。

焦点减少中和测试（FRNT）

FRNT 测定是根据先前建立的方案进行的，并进行了轻微修改21。将Vero E6细胞接种于96孔板中并培养至细胞汇合度大于90%。将来自 HFRS 患者的 10 份恢复期血清样品在 200 µL 感染培养基中连续稀释（1:20 至 1:43,740），与相同体积的 200 个病灶形成单位 (FFU) HTNV 混合，并在 37 °C 下孵育1小时。恢复期血清样本相关实验经空军军医大学唐都医院伦理委员会批准（批准号：202103-139）。然后用浓度为100μL/孔的血清-病毒复合物感染细胞，一式四份，并在37℃下吸附2小时。除去血清-病毒复合物后，用维持覆盖培养基覆盖每个孔。 5 dpi 后弃去覆盖培养基，将板固定、透化并用 3% 牛血清白蛋白 (BSA) (YEASEN) 封闭。使用 mAb 1A8 (1:1000) 在 4 °C 下过夜探测 HTNV NP。弃去1A8后，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG（1:1000，生工生物，D110087），室温孵育细胞1小时。洗涤三次后，将板用 3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺底物进行印迹（Biokits，北京，中国）在 37°C 下染色 30 分钟。然后将板干燥，并对病灶进行计数。计算 Nab 滴度。 FRNT50 定义为抑制 50% 细胞中 HTNV 感染的血清最大稀释度。对于小鼠NAb检测，采用相同的方法，但小鼠血清被稀释为1:10、1:20、1:40、1:80和1:160倍。

基于 GFP 的病灶减少中和试验

将指定稀释度的 HFRS 恢复期血清样品与 100 个噬斑形成单位 (PFU) 的 rVSV-HTNV-GP 在 37 °C 下孵育 1 小时。将血清-病毒复合物添加至 96 孔板中的 Vero E6 细胞中，并在 37°C 下孵育 7 小时。随后，将细胞固定在 4% PFA 中并用 Hoechst 33258 染色。使用 BioTek Cytation 5 成像阅读器（美国加利福尼亚州安捷伦）在 FITC 通道中获取图像，以可视化 GFP 阳性细胞。使用 Prism 软件（GraphPad 8.0, Inc., La Jolla, CA, USA）处理数据。

小鼠实验和伦理声明

6～8周龄雌性BALB/c小鼠由空军军医大学实验动物中心提供。所有动物研究均严格按照中华人民共和国科学技术部《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。动物研究方案经空军军医大学实验动物中心伦理委员会批准（批准号：20200403）。 HTNV 挑战实验在生物安全 3 级遏制设施中进行。

短期免疫制度

BALB/c 小鼠被随机分为五组（每组 n = 5）。给小鼠腹腔（ip）注射HFRS灭活疫苗、rVSV或rVSV-HTNV-GP，并以200μL（100μg）HFRS灭活疫苗注射3次，间隔3周。然后，给予 2 × 104 PFU 的 rVSV。对于 rVSV-HTNV-GP，给予 2 × 104、2 × 105 或 2 × 106 PFU 三种不同剂量。从rVSV或rVSV-HTNV-GP施用后4周以及疫苗接种方案完成后3周开始进行尾部取血。根据血清样本测定 HTNV 特异性抗体和 Nab 水平。通过免疫荧光测定（IFA）测定HTNV特异性抗体滴度。具体来说，用两倍连续稀释的免疫小鼠血清探测48孔板中HTNV感染的Vero E6细胞，并应用FITC缀合的抗小鼠IgG（1:400，Sangon Biotech，D110105）。使用最大有效双倍稀释度计算特异性抗体的滴度，同时仍为 HTNV 阳性。 HTNV中和抗体的滴度根据FRNT测定。放血后，在异氟烷(RWD，R510-22-10)麻醉后通过颈椎脱位对动物实施安乐死，收集脾细胞，并使用流式细胞术评估CD4+T细胞中的细胞因子。

为了评估保护效果，每组小鼠均接受 1 × 106 FFU HTNV 肌肉注射 (im) 攻击。 3 dpi 处死动物，并使用 qRT-PCR 测定肝脏、肺、脾和肾中的病毒载量。还测定了这些组织中炎症细胞因子的 mRNA 水平，包括 IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα 和 IFNβ。

初免-加强免疫制度

BALB/c 小鼠被随机分为四组（每组 n = 5）。给小鼠腹腔注射 HFRS 灭活疫苗、rVSV 或 rVSV-HTNV-GP。对于一种剂量方案，施用 2 × 105 PFU 的 rVSV 或 rVSV-HTNV-GP。对于双剂量方案，以 4 周的间隔施用两次 2 × 105 PFU 的 rVSV-HTNV-GP。接种疫苗后，进行尾部取血，并评估 HTNV 特异性抗体和 NAb。

长期免疫制度

通过 ip 途径对小鼠进行 2 × 105 PFU 的 rVSV 或 rVSV-HTNV-GP 免疫。灭活疫苗组注射三次，间隔3周。在 0、14、30、60、120、160、240 和 300 dpi 时从 rVSV-HTNV-GP 疫苗接种的小鼠中采集尾部出血。免疫一年后，对所有小鼠进行尾部采血，并测量 NAB。小鼠肌肉注射 1 × 106 FFU HTNV，并在 3 dpi 处死。评估了肝脏、肺和肾脏中的病毒载量和炎症细胞因子 mRNA 水平。

基于 RT-qPCR 的病毒负荷测量和细胞因子分析

将小鼠组织称重并在 TissueLyser II 仪器（QIAGEN，德国）中使用无菌不锈钢珠在 1 mL 补充有 2% FBS 的 DMEM 中均质化。使用总RNA分离（TRIzol）通用RNA提取试剂盒（天根，中国）从澄清的组织匀浆中提取总RNA。此外，按照制造商的说明，使用 Hifair II 第一链 cDNA 合成试剂盒 (YEASEN) 使用 1 μg 总 RNA 生成 cDNA。如前所述，使用 Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (YEASEN) 通过 RT-qPCR 测定病毒 RNA 水平，使用引物对 HTNV-S（正向：5′-GAGCCTGGAGACCATCTG-3’；反向：5′-CGGGACGACAAAGGATGT-3 ′)8。

使用 IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα 和 IFNβ 的特异性引物对测定炎症细胞因子的 mRNA 水平（补充表 1）。所有结果均标准化为 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 水平，并使用 2−ΔΔCt 方法与未感染 HTNV 的小鼠初始对照 (n = 5) 相比，确定每个结果的倍数变化。

细胞因子的流式细胞术分析

脾细胞在补充有 10% FBS 的 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640（Corning，Corning，NY，USA）中制备、悬浮和维持。使用包含覆盖全长 HTNV GP 的 8 个氨基酸残基重叠的 15 聚体肽以及蛋白质转运抑制剂混合物（3 小时后添加）刺激细胞 8 小时11,48。刺激后，加入 1 μL FVD-780，将细胞在 2–8 °C 下孵育 30 分钟。然后将它们清洗并用针对表面标记 CD3 单克隆抗体 (17A2) (eFluor 506, 2.5 μL/100 μL, eBioseience, 69-0032-82)、CD4 单克隆抗体 (GK1.5) (FITC) 的荧光团偶联抗体染色。，1.25 μL/100 μL，eBioseience，11-0041-82) 和 CD8a 单克隆抗体 (53-6.7)（PE-Cyanine7，2.5 μL/100 μL，eBioseience，25-0081-82）在室温下 60 分钟。然后用细胞内固定和透化缓冲液 (eBioscience) 处理细胞 30 分钟，1000 × g 离心 3 分钟，然后重悬。此外，抗细胞内 TNF α 单克隆抗体 (MP6-XT22) (PerCP-eFluor™ 710, 2.5 μL/100 μL, eBioseience, 46-7321-82)、IL-4 单克隆抗体 (11B11) (PE,添加0.625μL/100μL，eBioseience，12-7041-82)和IFNγ单克隆抗体(XMG1.2)(APC，0.625μL/100μL，eBioseience，17-7311-82)，并孵育30分钟。洗涤后，使用流式细胞仪（Agilent）分析脾细胞。

细胞因子的酶联免疫斑点测定

使用 ELISpot 试剂盒（MABTECH，NackaStrand，瑞典）按照制造商的说明测定细胞因子 IL-2、IL-4、IL-10 和 IFN-γ。将小鼠安乐死，解剖其脾脏并研磨成单核细胞悬浮液。红细胞裂解后洗涤并重悬脾细胞。室温下用含有 10% FBS 的 RPMI-1640 封闭 ELISpot 板 30 分钟后，将 1 × 106 个细胞/孔转移至 ELISpot 板，并用 10 μg/mL HTNV Gn/Gc 肽库在 37 ℃ 刺激 24 小时。 °C。添加伴刀豆球蛋白 A (1 μg/mL) 作为阳性对照。未刺激的细胞用作阴性对照。孵育 24 小时后，将链霉亲和素-HRP 和新鲜底物添加到板中。通过用去离子水冲洗板来终止反应。干燥后，使用ImmunoSpot®分析仪（Cellular Technology Ltd.，Santa Rosa，California，USA）测定斑点数量。

组织病理学

为了进行 H&E 组织病理学评估，对小鼠实施安乐死，快速分离其肝脏和肺，并在 4% PFA 中于 4°C 固定过夜，然后进行石蜡包埋。切片用 H&E 染色以分析组织病理学变化。使用全景 MIDI 仪器（3D HISTECH，匈牙利）捕获图像并使用 SlideViewer V2.6.0 软件进行分析。

统计分析

使用 Prism 版本 8（GraphPad 软件）在 P 值小于 0.05 时指定统计显着性。对于相关性分析，显示了 Spearman 相关系数 (R2) 和 P 值。使用单向方差分析 (ANOVA) 和 Dunnett 事后检验对小鼠接种疫苗后的特异性抗体和中和滴度进行分析。使用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 事后检验确定免疫小鼠中 HTNV 攻击后病毒载量或细胞因子水平的差异。