“呼吸组学”的新视角：使用 DI-FT-ICR-MS 对呼出气中的非挥发性有机化合物进行代谢组学分析

“呼吸组学”研究是指针对呼出气中挥发性有机化合物 (VOC) 的代谢研究17 号,18,19,20,21。 然而，“呼吸组学”的定义并不精确，因为它忽略了 nVOC，而 nVOC 可能包含有关呼吸的有价值的信息。 各种研究已经描述了健康人呼吸中挥发性有机化合物的不同情况24 还有患病的3,4,5,6,7,8 个人，同时错过了呼吸难题中可能重要的部分。 据我们所知，还没有公开的数据评估健康或患病受试者呼吸中的核心代谢组，特别是关注非挥发性成分的存在。 因此，为了完成这个拼图，我们首次对人类呼吸中的非挥发性化合物进行代谢组学分析。 这项研究的结果强烈强调，术语“呼吸组学”必须包括非挥发性有机化合物。 为了广泛了解人类呼吸，需要对 VOC 和 nVOC 进行同等检查。

迄今为止，人类呼吸组学数据库 (HBDB) 主要呈现包含 900 多种代谢物的 VOC。 然而，使用 HBDB 作为参考，我们仅识别出 147 种代谢物的重叠，仅占我们数据集中识别的 nVOC 总数的 5.5%。 值得注意的是，这项研究揭示了额外的 2509 种非挥发性有机化合物 (nVOC)，这些物质以前从未在人类呼吸中报告过。

呼气的最大优点是其非侵入性可及性，允许轻松且可重复的采样和测量21。 与呼出气体冷凝物相比，使用基于过滤器的设备9,12,13,25 呼吸收集似乎更实用，因为采样不需要冷却系统或冷凝器。 因此，我们使用了一种对患者友好的基于过滤器的设备9,12,25 （补充图。 1）适用于常规分析诊断。

该设备经过精心设计，用于收集源自气道内层液体的微粒。 由于收集过程的性质，唾液液滴可能会污染呼吸样本。 为了减轻口腔液污染，咬嘴设计用于从呼吸中分离唾液和较大颗粒，仅允许微小颗粒通过并收集在设备内部的过滤器上25,26。 然而，值得注意的是，尽管采取了这些措施，唾液液滴对检测到的代谢组的污染可能仍然很小。

此外，过滤提取不可避免地会导致物质损失。 然而，据报道，这里使用的该系统的收集效率可以假设在 90% 到 99% 之间9,12,25。

因此，我们开发了一种创新的分析方法，分多个步骤从基于过滤器的设备中提取代谢物，然后使用 FT-ICR-MS 测量样品，以获得呼吸中的全面代谢物模式。 我们的非靶向代谢组学方法27 极大地受益于超高分辨率质谱，可实现超宽测量范围 (65-1500 m/z) 的多样化检测、高动态测量能力以及飞摩尔范围内极高的灵敏度区分痕量。 然而，这种方法的最大挑战仍然是将确定的质量分配给分子结构27。 值得注意的是，这里提出的身份是假定的，但所示的化学式很可能是准确的。

在这项研究中，我们根据化学式鉴定了 2645 种假定代谢物，描绘了呼吸的非挥发性核心代谢组。 为了确保稳定性和广泛命中的有效性，进一步处理至少 15% 的所有样品中存在的已识别代谢物，产生 1138 种代谢物，选择用于统计分析。 重要的是，结果仅限于 HMDB 中列出的代谢物22 2023年和HBDB2即呼出气中存在的其他潜在代谢物因此被排除。

根据化学分类学，代谢物分为主要类别（图1）。 1）提供证据表明呼吸分析可以识别在人体内履行各种功能的生化多功能分子。 为了定义核心代谢组，我们使用了 HMDB22 2023 注释列表以及代谢物各自的 HMDB ID。 由于并非所有这些 ID 都存储在 MetaboAnalyst 5.0 中，因此按化学类别划分的检测到的代谢物的实际数量很可能比此处显示的要多。 然而，超过一半的检测到的代谢物用于确定核心代谢组。 根据呼出气的特征，人们会假设液滴主要含有亲水性代谢物。 令人惊讶的是，所发现的化合物具有很大的异质性。 亲水性物质（例如醇、氨基酸或碳水化合物）和亲脂性物质（例如甾醇、脂肪酸及其酯或缀合物）均被同等地检测到。 在物质类别中发现的化学主链的多样性以及生化功能值得注意。

此外，一些检测到的亲脂性化合物充当信号分子的前体，例如前列腺素代谢中的类二十烷酸以及免疫和炎症反应中的白三烯。 因此，呼气分析不仅可以用于炎症性疾病的研究，还可以用于评估信号转导途径和细胞信号传导。 与血液相比，呼吸显然含有可能分布在各种组织中的化合物，因此不限于肺系统。

此外，这项研究还调查了呼吸成分的性别差异。 在生物医学研究中，考虑试验中的性别特异性效应始终变得重要28,29,30。 因此，人类代谢组学中的性别模式已在各种生物流体中定义28,31,32,33,34。 然而，据我们所知，呼出气的性别特征仍然缺失。 本研究旨在填补这一空白。 为了分析特定的性别呼吸，志愿者根据自己定义的二元性别进行了划分。 使用单变量（火山分析）、多变量（PLS-DA）以及分类（随机森林）分析的生物统计评估揭示了有趣的发现。

如图所示。 2测量数据的随机森林分类分析被证明非常有效，因为所有 51 名男性受试者和 49 名女性受试者都被正确分配到各自的性别组（袋外误差 <1%）。 只有一名女性被错误地解释为男性。 此外，PLS-DA 的得分图描绘了男性和女性呼吸样本的清晰聚类分离（图 1）。 2b）而数据集的火山图确定了两组中超过 500 种重要的代谢物（图 1）。 2c）。 使用维恩图分析所有三种统计方法之间的重叠和差异（图 1）。 2d）作为一个有用的工具，首先，评估呼吸分析的所有测试的充分性和适用性，其次，统计确定最稳健的代谢物。 总体而言，在所有三种方法中，99 种代谢物被确定为相关，而火山图是最敏感的分析，识别出 384 种独特的命中。 尽管不同的统计分析产生不同的结果，但大量的重叠命中仍然证实了它们的适用性。 值得注意的是，对（最）统计相关代谢物的充分解释通常需要结合单变量、多变量和分类分析。 尽管如此，男性和女性的呼吸样本可以明显地区分，证明无论应用何种生物统计测试，呼吸代谢物都显示出特定的性别模式。

为了对特定性别模式进行细致评估，使用包含 515 种代谢物的 HMDB 性别数据库对已识别的代谢物进行了重新注释。 根据该数据库，19 种性别特异性代谢物（调整后的 p 值< 0.1, FC >1）得到（表 2）。 有趣的是，将我们的结果与文献中描述的血液或尿液样本代谢物的性别特异性模式进行比较，我们只发现八个匹配项证实了已发表的性别分布。 其中六种代谢物在男性中显着较高，两种代谢物在女性中表现出较高的强度。

例如，结果显示，与女性相比，男性呼出气中的尿酸强度更高，这与据报道男性血清尿酸水平更高的事实相一致35,36,37,38,39。 鸟氨酸也报告了相同的模式31,40。 此外，男性血液样本中某些氨基酸的浓度较高31,32,40,41,42,43。 我们的结果通过观察男性受试者呼吸样本中脯氨酸和酪氨酸水平显着升高来支持这些发现。 然而，也有报道称，女性的丝氨酸浓度更高31这也与我们的结果相关。 另一种在女性中表现出较高强度的代谢物是次黄嘌呤。 起初，女性表现出较低的尿酸强度但较高的次黄嘌呤水平似乎是矛盾的。 然而，这两种结果已在文献中讨论过，并且与女性黄嘌呤氧化酶活性潜在升高有关44,45。

有趣的是，与 HMDB 性别数据库中描述的分布相比，其余 11 种重要代谢物在我们的数据中表现出相反的强度模式。 例如，女性志愿者中的维生素 C 及其代谢物苏糖酸和肉豆蔻脑酸含量较高。 然而，与 HMDB 相反22皮尔逊等人。 支持这些结果，表明未经治疗的男性空腹维生素 C 血浆水平通常低于女性46。 另一项研究也显示出相同的结果47然而，做出一般性陈述仍然具有挑战性，特别是由于个人饮食对维生素 C 及其代谢物浓度的直接影响。

此外，我们能够观察到女性受试者中磷脂酰胆碱和各种肉碱的强度较高，这与 HMDB 分配和其他报告相矛盾41,48。 总之，我们的研究结果证实了这样的假设：与其他生物液体相比，呼出的气体显示出不同的性别特异性模式。 因此，探索呼吸似乎很有前途，特别是在生物标志物研究中，因为它在某种程度上与其他生物液体一致，但也可能增加有价值的信息。 在呼出气中发现不确定但部分一致的性别特异性模式可能归因于生物体液、血液和呼吸中的细胞源自人体内的不同屏障。 因此，两种生物流体都与不同类型的细胞直接接触。 鳞状内皮细胞排列在血管的内表面49,50 而呼出的气体仅通过简单的上皮细胞层51,52。 因此，内皮和上皮屏障包含具有独特功能的相对独特的细胞类型49,50,52。 这可能会导致代谢模式略有不同。

观察到的男性和女性差异的主要偏差可能是由于女性肺容量较小53可能会导致在 30 次呼气中收集到数量显着不同的生物材料。 然而，在使用该设备时，通过遵循制造商的说明来标准化呼吸采样。 标准化采样过程使用塑料袋，填充后表明有足够的呼吸量通过收集过滤器28。 这意味着女性肺容量较小的潜在影响可能不会显着影响结果。

值得注意的是，其他协变量（饮食习惯、饮酒、吸烟、体力活动等）对性别特异性代谢模式的影响似乎可以忽略不计，因为每个协变量对应的群体大小在男性和女性之间均匀分布。补充数据）。 此外，年龄或其他个体形态数据（例如体重指数）可能在性别差异中发挥作用，因此可能会引入潜在的偏差32,34,40,54,55,56。 本研究纳入了年龄在 20-40 岁、BMI 正常（19.0-25.0 kg m-2）的志愿者，即老年人口未被纳入。 因此，有必要进一步研究探讨衰老和其他形态特征的影响。

除了性别差异外，口服避孕药的摄入也会影响代谢组。 在我们的研究中，我们纳入了每天服用口服避孕药的 50 名女性中的 16 名。 倍数变化分析以及 Tukey HSD 事后测试揭示了服用口服避孕药和未服用口服避孕药的女性之间有趣的代谢物存在显着差异。 例如，维生素 B6 衍生物吡哆醛在未采取避孕措施的女性中表现出更高的强度。 鲁蒙等人。 据报道，使用口服避孕药的女性存在吡哆醛缺乏症。 他们发现磷酸吡哆醛的血浆水平在各组之间具有相同的分布57,58 如此处介绍的。

有趣的是，我们发现拒绝口服避孕药的女性体内左旋多巴的代谢物（例如高香草酸）含量最高。 激素制剂影响某些氨基酸和神经递质的生物合成以及代谢似乎是一致的58,59,60。 进一 3）。

总的来说，我们的研究结果明确表明口服避孕药显着影响代谢组模式。 然而，应该考虑到结果是基于相对较小的人口。 这种影响可能会随着年龄的增长或绝经后女性而减弱34,40,55,56。 根据 Ruoppollo 等人的说法。41 和劳舍尔等人。48我们的结论是，未来的研究通常需要考虑代谢组学方法中与口服避孕药摄入相关的影响。

然而，在不考虑月经周期的情况下评估口服避孕药的效果会给我们的分析带来相当大的偏差。 我们主要关注检查口服避孕药的一般效果。 为了分析结论性的影响，考虑到月经周期之间存在相当大的差异，未来的研究必须考虑确切的月经周期，需要更大的群体规模和时间依赖性分析。

除了特定性别的模式和口服避孕药的摄入量之外，还测试了各种生活方式因素的影响。 有趣的是，重要的代谢物证实了酒精摄入对人类呼吸代谢组模式的影响。 与经常饮酒者和适度饮酒者相比，不饮酒者的六种代谢物显着增加，其中大多数与脂质代谢有关。 在戒酒组中发现化学式 C16H22O3 的命中率显着较高，在之前的 NMR 研究中被鉴定为 15-oxo-5,9,11,13-十五碳四烯酸甲酯61。

此外，亚麻酸作为花生四烯酸的前体，在生成各种相关代谢物（包括 12-羟基二十碳四烯酸 (12-HETE)）方面发挥着重要作用625,6-环氧-8,11,14-二十碳三烯酸 (EET)62EP-9 KODE（十八烷氧脂）和氢过氧化亚油酸63所有这些对不饮酒的人都有显着影响（图 1）。 3）。 EP-9 KODE 和 12-HETE 由亚油酸通过脂氧合酶和环氧合酶等酶的活化形成62,63 被称为花生四烯酸的第一和第二途径。 此外，花生四烯酸可以通过CYP环氧化酶转化为EET，代表花生四烯酸代谢的第三条途径62。 这证明 EB 分析可能有助于监测不同代谢途径的变化。

研究表明，酒精可以通过影响酶的表达和活性来影响脂肪酸代谢，例如降低 5-脂氧合酶的活性64参与 HETE 形成65。 醉酒时，身体优先考虑酒精代谢，可能导致酒精氧化增加，相反，脂肪酸代谢减少。 这可能是亚麻酸可用性降低的原因66 从而降低相关代谢物的浓度。 导致亚麻酸合成减少的另一个原因可能是所讨论的酒精对 δ 去饱和酶活性的抑制作用66。

此外，5′-羧基-γ-苯并二氢吡喃醇 (γ-α-CHMBC) 是维生素 E 代谢中最丰富的中间体67,68不饮酒的志愿者表现出更高的强度。 各种研究报告了生育三烯酚的有益作用，包括对患者的肝脏保护作用69 以及肝脏甘油三酯合成的潜在减少及其运输的改善70。 众所周知，饮酒会升高甘油三酯水平71它可能导致生育三烯酚和相应代谢物水平降低。 因此，这些可能无法有效防止中度和经常饮酒者的甘油三酯升高。

此外，由于吸烟者的群体规模非常小（101 人中的 10 人），因此将吸烟者与非吸烟者进行比较，没有发现任何重大影响。 然而，我们在三名吸烟者的所有技术重复中检测到了化学式为 C35H66O8 的代谢物增加，值得注意。 这种化合物的假定身份是东海糖辛（acetogenin），一种在番荔枝科植物中发现的聚酮化合物72。 有趣的是，它也可能起源于烟草甲虫，其中聚酮化合物在性信息素的合成中发挥着至关重要的作用73。 据报道，acetogenins 具有潜在的神经毒性72,74。 这表明EB中也可检测到外源性有毒物质。

此外，我们发现在饮用咖啡的志愿者中，一种化学式为 C15H9FO2 的代谢物显着增加。 它可能源自咖啡本身或人类微生物组。 然而，尚未描述该化学式的推定代谢物，其精度已确认为 <1 ppm，mSigma 值为 15（同位素精细结构的程度）。 尽管如此，应该考虑到 101 名志愿者中只有 9 名没有喝咖啡或含有咖啡因的食物/饮料。 群体规模的不平等可能导致了这一统计结果。 所有其他生活方式因素，如身体活动、过敏、补充剂的摄入和其他个人饮食，都没有产生显着的结果。

总的来说，这些因素似乎高度不确定，并对研究人群的标准化提出了重大挑战。 为了识别基于身体活动的显着差异，不仅区分锻炼频率，而且区分身体活动和运动的多样性可以提供有价值的见解。 观察到的体力活动影响有限可能是由于报告没有体力活动的个体规模较小（11%）。 这同样适用于过敏和不耐受，只有 15 名参与者报告了这些问题。 这些涵盖了广泛的过敏和不耐受，包括乳糖、果糖、麸质、坚果、西红柿、各种水果，如苹果、石榴、覆盆子、樱桃等。由于这些食物不耐受和过敏的性质不同，他们可能不共同导致个体中相同的代谢模式，并且差异可能不足以产生结论性的结果。 此外，饮食习惯和膳食补充剂摄入量方面的微小变化可能归因于所施加的限制，该限制禁止参与者在采样前两小时内食用任何食物或饮料。 然而，为了评估基于营养的显着变化，未来的研究应考虑在食物摄入后立即取样。 此外，通过交叉引用不同的食物和营养数据库进行代谢注释，可以获得重要的发现。 我们的研究结果仅限于 HMDB 2023 和 HBDB 列表。 因此，两个数据库中均未列出的可能存在于呼出气中的代谢物仍未被检测到。

然而，总的来说，该研究可能缺乏统计能力来可靠地评估各种协变量的影响，特别是由于群体规模较小。 然而，这些发现表明上述生活方式因素存在相当大的个体间差异，也可能存在个体内部差异。 然而，为了更好地说明总体趋势，需要进行大规模研究。

此外，应该指出的是，在一天中的两个不同时段之间，个体间和个体内液滴的产生可能存在很大差异。 然而，由于研究设计，呼吸样本是在半小时内收集的。 因此，所获得的结果并不能最终解释不同时期液滴的变化。 未来的研究应该旨在比较多个时期的采样，以有效评估液滴的变异性，从而有可能揭示全天不同的个体间和个体内代谢模式。

此外，HMDB 注释列表显示了本研究的一个重大弱点。 利用这些可能会导致令人难以置信或有问题的注释代谢物（补充数据），可能是由于存在许多具有相同化学式的同量异位化合物。 在这些情况下，MetaboAnalyst 从注释列表中选择第一个列出的代谢物，这可能会导致某些代谢物的分配存在问题。 因此，尽管所提供的化学式非常准确，但这种分析方法只能提出假定的身份。 此外，尽管方法存在差异，呼气研究中最大的挑战是样本收集的标准化，需要进一步优化分析方法。

这项概念验证研究展示了一种引人注目的代谢组学方法，用于诊断方法中的呼出气分析。 我们描绘了据称健康受试者的代谢组学概况。 然而，患有特殊疾病的患者可能会表现出有趣的代谢模式，可能与健康受试者的代谢模式有所不同。 因此，未来对呼出气的研究应该应用这种代谢组学方法来检查代谢物，这些代谢物确实可以作为各种疾病的潜在生物标志物，特别是缺乏早发症状的疾病。

总之，本研究的结果表明通过纳入 nVOC 来扩展“呼吸组学”的定义。 DI-FT-ICR-MS 成功应用于描绘非挥发性代谢组呼吸图，为呼出气中临床生物标志物的发现奠定了基础。 与其他生物材料相比，呼出气不仅同样适用，而且易于检测各种代谢物，提供多样化、有利的视角。 因此，呼出气的代谢组学分析可能会揭示重要的代谢物，以了解某些疾病的发病机制或建立诊断性呼吸纹。 将鸟枪式 DI-FT-ICR-MS 合理集成到呼出气分析中是实现这一目标的绝佳工具。 然而，总的来说，评估健康个体呼吸中与性别和年龄相关的差异是提出从实验室到临床的转化应用的第一步。 因此，这种方法也可能适用于个性化医疗。

2024-03-02 12:51:04
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