患有和不患有糖尿病的 PLA 患者的肠道菌群

介绍

化脓性肝脓肿（PLA）是由化脓性细菌通过各种途径侵入肝脏，在肝内形成单个或多个脓液积聚而引起的传染病。1，2 近年来，中国和韩国成年人口中PLA的发病率明显上升。3–5 美国儿童肝脓肿的发病率也呈上升趋势。6 患有 PLA 的患者通常不会出现特定症状。但是，如果感染得不到有效控制，可能会发展为播散性感染、败血症，甚至可能导致死亡，尤其是患有 2 型糖尿病 (T2DM) 的患者。5，7，8 与无糖尿病的 PLA 患者相比，患有糖尿病的 PLA 患者往往会出现更严重的症状。9，10 预计2021年中国成年人将有超过1.4亿人患有糖尿病，到2045年这一数字预计将增至1.74亿以上。11 因此迫切需要有效的PLA预防和治疗策略。

材料与方法

研究人群

本研究经连云港市第一人民医院医学伦理委员会批准（编号KY-20181213001），所有受试者均知情同意。

PLA的诊断标准包括：1）有发热、畏寒、恶心、肝区不适、乏力、肝区压痛或叩击痛等临床表现；2）经腹部多普勒超声、CT、MRI等影像学检查确诊肝脓肿；3）临床细菌学检查阳性或经有效抗菌药物治疗确诊；4）经经皮肝穿刺或手术治疗确诊为细菌引起的化脓性感染。患者需同时符合标准1和标准2，以及标准3和标准4中的一项或两项，方可纳入研究。糖尿病诊断按照美国糖尿病协会标准。23

2021 年 2 月至 2022 年 1 月期间，从中国江苏省连云港市第一人民医院招募了 93 名受试者，其中包括 32 名患有糖尿病的 PLA 患者（T2DM+PLA 组）、32 名无糖尿病的 PLA 患者（PLA 组）和 29 名年龄和性别匹配的 HC（健康对照组）。

患者数据包括基本人口统计学信息、临床表现、潜在疾病、实验室检查结果和影像学检查结果，均来自本机构的病历、实验室信息系统和图像获取与通信系统。

样本采集和 DNA 提取

采集 PLA 组和 HC 组的新鲜粪便样本用于分析肠道菌群。采集后 4 小时内在实验室处理样本，然后储存在 −80°C 下直至分析。根据制造商的说明，使用 QIAamp PowerFecal DNA 试剂盒（德国 QIAGEN）从粪便样本（0.5 g）中提取 DNA。

聚合酶链式反应 (PCR) 和 16S rRNA 扩增子测序

使用引物 341F 5′-CCTACGGGNBGCASCAG-3′ 和 805R 5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′ 进行 PCR 扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3-4 区（95°C 3 分钟，然后 25 个循环，95°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒，最后在 72°C 延伸 5 分钟）。使用 AMPure XP 珠子进行 PCR 净化，以纯化 16S V3 和 V4 扩增子，使其脱离游离引物和引物二聚体。 纯化产物经 PCR 扩增（95°C 3 分钟，然后 8 个循环，95°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒，最后 72°C 延伸 5 分钟），引物的条形码是每个样本独有的 8 个碱基序列。随后用 AMPure XP 珠子纯化扩增子，以在定量前清理最终文库。最后，将纯化的扩增子等摩尔合并，并根据标准方案在 Illumina MiSeq 平台上进行双端测序（2×250）。

生物信息学分析

使用快速短读长调整 (FLASH) 合并来自下一代测序的双端读长。过滤低质量读长，删除嵌合体读长。通过基于最小样本量随机减法对每个样本的读长进行归一化。使用 UCLUST 算法对具有 97% 同一性的操作分类单元 (OTU) 进行比对，并使用 SILVA 16S rRNA 数据库 (v128) 进行分类。使用定量微生物生态学洞察 (QIIME) 生成 alpha 和 beta 多样性，并基于加权和非加权 UniFrac 距离矩阵计算。我们使用线性判别分析效应大小 (LEfSe) 方法来识别各组间丰度存在统计学显着差异的物种。

统计分析

正常测量数据以平均值±标准差表示，并使用独立的 吨-检验。非正态分布数据以M（P25，P75）表示，比较采用Mann-Whitney 乌-检验。使用 SPSS 27.0 和 GraphPad Prism9 软件进行统计分析和绘图。 磷-值小于 0.05 被认为具有统计学意义。

结果

患者临床特征

基于93份粪便样本的16S rRNA基因测序分析三组肠道菌群特征。α多样性反映肠道微生物的丰富度和多样性。肠道微生物丰富度以观测到的菌种数计算，Chao1多样性指数和肠道微生物多样性以Shannon和Simpson多样性指数计算。T2DM+PLA组和PLA组肠道菌群丰富度和多样性均显著低于HC组（磷 < 0.01； 图 1A–D)。与PLA组相比，T2DM+PLA组肠道菌群丰富度和多样性均降低，但差异不显著。β多样性反映了肠道菌群的组成。加权UniFrac距离的主坐标分析表明，T2DM+PLA组与PLA组粪便菌群差异不显著。与PLA组相比，T2DM+PLA组粪便菌群与HC组差异更大（ANOSIM， 磷 < 0.01； 图 1E)。PLA组肠道菌群分散性较大，提示不同个体肠道菌群组成存在显著差异(图 1E）。

我们评估了三组细菌在门和属水平上相对丰度的差异。在门水平上， 拟杆菌含有许多有益共生生物的肠道菌群在 T2DM+PLA 组和 PLA 组中的含量与 HC 组相比较低。相反， 变形菌 在 T2DM+PLA 和 PLA 组中显著更高（磷 0.05)。T2DM+PLA组与PLA组比较， 拟杆菌 T2DM+PLA 组降低，但这种差异并不显著（图 2A 和 2C， 磷=0.11, Z=1.60)。在属水平上， 湿的 和 普雷沃氏菌9 与 HCs 相比，两个 PLA 组的磷 < 0.05）。相反， 肠球菌 和 大肠杆菌-志贺氏杆菌 两组 PLA 的含量显著高于 HC（磷 < 0.05)。 拟杆菌 和 粪杆菌 与 HC 组相比，T2DM+PLA 组的磷 < 0.05）。同样，与 PLA 组相比， 乳酸杆菌 和 克雷伯氏菌 在 T2DM+PLA 组中显著降低（图 2B 和 表 2）。

为了确定各组间关键生物标志物的差异，我们进行了 LEfSe 分析，以表征各组间的物种差异。HC 组和 PLA 组之间共有 77 个属表现出显著差异。其中，HC 组发现了 60 个属，PLA 组发现了 17 个属（图 3A 和 BHC组与T2DM+PLA组有84个属表现出显著差异，其中HC组有63个属，T2DM+PLA组有21个属（图 3C 和 德）。比较两组 PLA 时，在 9 个属中观察到了显著差异。在 PLA 组中，肠道微生物组以 乳酸杆菌，毛螺菌科NC2004G群，真杆菌群，毛螺菌，艾森伯格菌，粪球菌2和 龙布特属; 相反，在 T2DM+PLA 组中，微生物组主要由 厌氧孢杆菌和巨单胞菌 （图 3E 和 F）。

该属的丰度 乳酸杆菌 和 克雷伯氏菌 与 PLA 组相比，T2DM+PLA 组的微生物群下降。T2DM 患者的微生物群主要特征是 肠罗斯氏菌 和 普拉斯尼茨粪杆菌 伴有中度菌群失调、促炎环境和肠道通透性增加。三十七 2 型糖尿病患者菌群变化与 PLA 之间的相互作用尚待进一步研究。致病菌 肺炎克雷伯杆菌 在患有糖尿病的 PLA 患者中很常见。10，三十八 Zhang 等人证明 肺炎克雷伯杆菌 肝脓肿是由 肺炎克雷伯杆菌 以及其他细菌。三十九 Guo 等人报道了 克雷伯氏菌 合并糖尿病的PLA患者脓腔内细菌数量高于未合并糖尿病的PLA患者。20 这可能反映了 肺炎克雷伯杆菌 在 克雷伯氏菌属; 或者，细菌相互作用可能导致 肺炎克雷伯杆菌在动物模型中， 肺炎克雷伯杆菌 菌株能够穿过肠道屏障并通过门静脉进入肝脏。40 因此，肠道微生物失衡可能破坏了肠道屏障，增加了肠道通透性。结果，病原体进入门静脉和肝脏，导致 克雷伯氏菌有趣的是，肠道菌群组成的变化已被证明会显著影响宿主体内代谢物的水平。41，四十二 为了了解潜在的机制，有必要使用有针对性的代谢组学进行进一步研究。

这项研究有一些局限性。首先，这是一项单中心研究，样本量有限，结果尚属初步。需要进一步研究以在更多样化的人群中验证研究结果。其次，需要进一步研究以确定将 PLA 与肠道微生物群变化联系起来的具体机制。

结论

综上所述，我们发现PLA合并糖尿病患者临床症状比不合并糖尿病患者严重，同时我们还观察到PLA合并糖尿病患者的肠道菌群与不合并糖尿病的PLA患者和HCs相比有显著变化，与HCs相比，PLA合并糖尿病患者的肠道菌群多样性降低，组成成分发生明显变化，这些发现为PLA的预防和治疗奠定了理论基础。

数据共享声明

本研究中使用的和/或分析的数据集可从相应的作者处获得。

伦理批准

本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则，连云港市第一人民医院伦理委员会批准了本研究，患者/参与者签署了书面知情同意书，同意参与本研究。

致谢

我们感谢入选患者对我们研究的配合，并感谢所有参与研究的工作人员所表现出的专业精神和同情心。此外，我们还要感谢微生物研究所微生物资源国家重点实验室为样本 16S rRNA 分析和数据分析提供的帮助。作者感谢 AiMi 学术服务 (www.aimieditor.com) 提供英语语言编辑和审阅服务。

作者贡献

资金

该项研究得到了科技部国家重点研发计划（批准号：2019YFC1200702）的资助。

披露

作者声明，该研究是在不存在任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

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