比格犬中新型 H3N2 犬流感病毒基因型的生物学特性和感染动态 | 病毒学杂志

道德声明

动物协议已获得上海市动物疾病控制中心实验动物伦理委员会的批准。

系统发育分析

2019 年来自上海的 6 个 H3N2 CIV 分离株（A/canine/China/Shanghai/0103/2019；A/canine/China/Shanghai/0104/2019；A/canine/China/Shanghai/0105/2019；A/canine/China/Shanghai/018/2019；A/canine/China/Shanghai/019/2019；A/canine/China/Shanghai/0114/2019）的血凝素 (HA) 基因用于遗传和系统发育分析（登录号：MK758007.1–MK7580054.1）。使用 Lasergene 序列分析软件（Dnastar Inc.，美国威斯康星州麦迪逊）编译和编辑序列数据。 使用 CLUSTAL W 进行多重序列比对。在 MEGA 4 中使用 1,000 次引导重复构建了用于起源分析的最大似然树 [19, 20]。

病毒繁殖和电子显微镜

A/canine/Shanghai/0103/2019 (H3N2) 是从中国上海的一只流浪狗身上分离出来的。该病毒在 9 日龄无特定病原体 (SPF) 鸡胚中在 37 °C 下繁殖 48 小时，并储存在 -80 °C 下。病毒滴度采用 50% 鸡蛋感染剂量 (EID50/ml) 方法评估，并采用 Reed–Muench 方法计算 [21]。使用 MDCK 细胞分离病毒时，使用 1 µg/ml TPCK 处理的胰蛋白酶来支持病毒生长。感染细胞在 37 °C 下 5% CO2 孵育 72 小时。收获上清液并进一步传代。然后，使用 RT-PCR（Qiagen，深圳）检测感染。将 H3N2 病毒（A/canine/Shanghai/0103/2019）吸附在碳 parlodion 涂层铜网上 2 分钟。用滤纸吸干多余的悬浮液，然后立即用 1% 磷钨酸染色网格 10 分钟。用滤纸去除多余的染色剂，然后使用透射电子显微镜（Hitachi，日本）检查样品。

临床研究和病毒挑战

从实验动物中心（上海润德生物技术有限公司）获得 16 只比格犬（10 周龄）。研究前，采集所有犬的血清样本并进行血凝抑制 (HI) 测定，以确保动物未接触过 H3N2 CIV。四只犬作为对照。对于鼻腔给药，将剩余的 12 只犬分成三组，分别鼻腔接种 1 ml 的 104、105 或 106 EID50 A/canine/Shanghai/0103/2019。对照组鼻腔接种等量的无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)。将犬饲养在单独的笼子中，并在感染后观察 10 天。

血清学检测

在感染后 2、4、6、8 和 10 dpi 时采集狗的血液样本。从每只狗身上采集约 500 µl 血清，并储存在 -20 °C 下直至需要。将一体积血清与三体积受体破坏酶 (RDE，Denka Seiken Co., Ltd.) 混合，在 37 °C 下孵育 18 小时，然后在 56 °C 下孵育 30 分钟。使用 HI 测定法确定抗血清滴度。本研究中使用的 1% 红细胞是从 SPF 公鸡身上采集的，并在无菌 PBS 中稀释。

使用苏木精和伊红 (H&E) 和免疫荧光 (IF) 染色进行组织病理学检查

5 dpi 时收集的肝脏、脾脏、肺、气管和肠道组织在 10% 福尔马林中固定 48 小时以上。样品清洗过夜，在酒精中脱水，并嵌入石蜡中。接下来，将石蜡包埋的组织切成 4-7 μm 厚的切片并放置在玻璃载玻片上。然后将切片安装并在 37 °C 下放置过夜，然后进行 H&E 染色。

对脱蜡和复水后的组织切片进行 IF 染色。简而言之，首先在高压锅中用抗原修复液（美国加利福尼亚州 Vector Laboratories）处理切片。在室温下用 0.1% 苏丹黑 B 封闭 15 分钟，用 1% 牛血清白蛋白/PBS 封闭 30 分钟，然后将膜与抗 IAV 核蛋白的一抗（Abcam）在 4 °C 下孵育过夜。随后用 Cy5 偶联的山羊抗鼠 IgG（Abcam）孵育 30 分钟，之后用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（赛默飞世尔科技）染色切片。使用 Carl Zeiss LSM780 共聚焦显微镜检查所有切片并拍摄图像。

统计分析

使用 GraphPad Prism (v.7.02) 软件 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)，通过单因素方差分析和事后 Tukey 多重比较检验来确定统计学意义。P 值 < 0.05 表示统计学意义。