环境氧化铝诱导具有免疫功能的人体神经血管单元神经变性

细胞培养

永生人内皮细胞（h3MEC/D3细胞）购自Cedarlane Laboratories（加拿大安大略省），并在涂有100 μg/mL I型胶原蛋白（Corning Inc.，NY，USA）的培养皿中生长，并使用EC增殖培养基(ECPM) 包含内皮细胞生长基础培养基-2（EBM-2，Lonza，巴塞尔，瑞士）、1% v/v 青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）、1.4 μM 氢化可的松，10 mg /mL 酸性抗坏血酸、1% v/v 化学成分确定的脂质浓缩物、10 mM HEPES (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)、20 ng/mL bFGF (Stemgent, Cambridge, MA,USA) 和 5% v/v 胎儿牛血清（FBS，Sigma-Aldrich）。 达到 90% 的细胞汇合后，我们用 2.5% 胰蛋白酶 EDTA (Sigma-Aldrich) 分离细胞，重悬于新鲜的 ECPM 中，并在涂有 100 μg/mL I 型胶原蛋白的新培养皿中传代培养。

人神经祖细胞（ReN 细胞，EMD Millipore，Billerica，MA，USA）在涂有 1% v/v Matrigel（Corning Inc.）和由 DMEM/F12 培养基（ThermoFisher Scientific）组成的 PM（0.1）的培养皿中生长。 % v/v 肝素 (Stemcell Technologies)、2% v/v B27 无血清补充剂 (ThermoFisher Scientific)、1% v/v PSA 抗生素溶液 (Lonza)、20 μg/mL bFGF 和 500 ug/mL EGF (Sigma) -奥尔德里奇）。 一旦细胞达到 80% 汇合，使用 Accutase (Gibco-BRL) 分离 ReN 细胞，重悬于新鲜 PM 中，并在涂有 1% v/v 基质胶的新培养皿中传代培养。

永生化人星形胶质细胞（SV40 细胞，ABM Inc.，Richmond，BC，加拿大）在涂有 40 μg/mL I 型胶原蛋白的培养皿中生长，星形胶质细胞 PM (ACPM) 由 Prigrow IV (ABM Inc.)、10 ng 组成/mL EGF、1% v/v 青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺 (Gibco-BRL) 和 5% v/v FBS。 细胞达到80%汇合后，用2.5%胰蛋白酶EDTA剥离，重悬于ACPM中，并在新的涂有40 μg/mL I型胶原蛋白的培养皿中传代培养。

AlNP溶液的制备

铝₂氧₃ 纳米颗粒 (AlNP) 购自 PlasmaChem GmbH（德国柏林）。 去离子水中纳米颗粒的平均尺寸和 zeta 电位为 40 nm 和 47.18 ± 2.829 mV（平均值 ± SD）。 AlNPs 最初制备为分散在二甲基亚砜（DMSO，Biosesang Inc.，Seongnam-si，Korea）中的储备溶液（1 mg/mL）。 使用前，我们在适当的培养基中稀释，并在室温 (RT) 下超声处理 30 分钟，以将颗粒分散在溶液中¹⁵。 最终浓度和培养基的选择根据实验设置和手稿中的说明而有所不同。

芯片制造

为了制造器件模具，使用光刻技术将 SU-8（MicroChem，Newton，MA）在 4 英寸硅晶片上进行负图案化。 我们之前的研究中描述了与设备制造相关的细节⁴⁵。 为了制备复制模具，我们将聚二甲基硅氧烷（PDMS）和固化剂（Sylgard 184 A/B，Dowhitech，Goyang-si，Korea）以 10:1 的比例混合，将混合物倒入有图案的二氧化硅晶片上，并在 60 ℃下孵育模具。 ℃ 4 h 固化。 将固化的 PDMS 复制品从模具上剥离，并为储液器创建孔。 用于介质储存器的塑料室是用计算机控制的 Zing 激光切割机（Epilog Laser，Golden，CO）和 6 毫米厚的丙烯酸板制造的。 使用 PDMS 将复制的 PDMS 和塑料层粘合在一起。 通过氧等离子体处理（Plasma Etch，Carson City，NV）将所得组件不可逆地粘合到定制的玻璃底单孔板（MatTek，Ashland，MA）上。 在设备上进行细胞培养之前，我们用 DMEM/F12 中稀释的 1% v/v 基质胶涂覆每个室 1 小时，并用 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS，Lonza，Hopkinton，MA）彻底清洗。

hNVUI模型的制备

我们开发了 hNVUI 模型来研究穿透 BBB 的 AlNP 促进星形胶质细胞增生和神经元损伤的潜在机制。 我们用 10 μL 聚 D-赖氨酸（PDL，1.0 mg/mL，Sigma-Aldrich）包被微流体的 RC 和 LC，在室温下孵育 20 分钟，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS，Biosesang Inc.）洗涤。 。 RC进一步涂有1％v/v基质胶，37℃孵育30分钟，并用PBS彻底清洗。 随后，我们加载了 10 μL ReN 细胞（5 × 10⁶ cells/mL) 到 RC 并在 5% CO 中孵育设备₂ 细胞培养箱37℃培养30分钟，确保细胞完全贴壁。 然后，加入50 μL新鲜分化培养基（DIM），每3.5天更换一半体积的DIM，直至祖细胞完全分化为神经元和星形胶质细胞（约3周）。 每 3.5 天更换一半培养基是为了防止由于 3D 培养模型中营养物质短缺而导致的任何意外细胞损伤^15,32,38。 在 EC 加载之前，我们在 37 ℃下用 2 mg/mL I 型胶原蛋白包被 LC 30 分钟，并用 PBS 洗涤。 我们将 10 μL EC 以 10 的密度加载到胶原蛋白包被的 LC 中。⁷ 细胞 mL 并将设备置于 5% CO 中₂ 细胞培养箱37℃培养4天。 值得注意的是，我们将器件倾斜 45°，以便 ECs 可以通过重力在面向 RC 的 LC 侧壁上形成 BBB。 BBB 形成完成后，我们将 1 ng/mL 的 AlNP 添加到 LC 中并在 5% CO 中孵育₂ 细胞培养箱37℃培养4天。

其他体外模型

对于单培养 BBB 模型，我们用 2.5% 胰蛋白酶 EDTA 分离 h3MEC/D3 EC，重悬于新鲜 ECPM 中，并加载到涂有 100 μg/mL I 型胶原蛋白的 96 孔板（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA）中。接种密度为20,000个细胞/孔。 为了增加 BBB 紧密连接，我们通过将培养基从 ECPM 更改为 ECDIM 进行血清饥饿 4 天。

对于神经元和星形胶质细胞的共培养模型，使用 Accutase 分离 ReN 神经祖细胞，并以 10,000 个细胞/孔的接种密度加载到涂有 1% v/v Matrigel 的 96 孔板中。 ReN与DIM一起培养3周，诱导神经祖细胞分化为神经元和星形胶质细胞。

对于单培养的星形胶质细胞，SV40星形胶质细胞达到80％汇合后用2.5％胰蛋白酶EDTA分离，重悬于ACPM中，并在接种时接种于涂有40μg/mL I型胶原蛋白的96孔板中密度为 10,000 个细胞/孔。

BBB渗透性评估

为了研究 AlNPs 对 BBB 紧密性的影响，我们评估了经过或不经过 AlNPs 处理的 40 kDa FITC-葡聚糖 (Sigma-Aldrich) 的渗透率。 AlNP 处理完成后，我们将 10 μg/mL 40 kDa FITC-葡聚糖添加到 hNVUI 的 LC 中，并每 6 小时至 24 小时从 RC 侧收集条件培养基。 我们通过 Bio Tek Gen5（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）测量了 BBB 穿透 FITC-葡聚糖的浓度。 每个样品穿过 BBB 的表观渗透性（磷_血脑屏障）通过等式计算。 1 如前所述^15,46：

在此等式中，C_L （微克/毫升），C₀ (微克/毫升), V (厘米³), S (厘米²)，t(s)分别代表RC中FITC-葡聚糖的浓度、LC中FITC-葡聚糖的初始浓度、RC的体积、连接LC和RC的微通道的表面积以及BBB渗透的时间。

活性氧评估

我们用 1 ng/mL 的 AlNP 处理单培养的星形胶质细胞 2 天，并用 10 pg/mL 的 AlNP 共培养神经元和星形胶质细胞 4 周。 然后，我们用 10 μM C​​ellROX™ 绿色试剂 (ThermoFisher Scientific) 对模型进行染色，荧光探针检测细胞内 ROS，在 5% CO 中染色 30 分钟₂ 细胞培养箱。 我们用PBS清洗模型3次，并通过配备FITC滤光片的荧光显微镜（Nikon TiE显微镜，尼康，日本）实时测量荧光强度。 我们使用 NIS-Elements 软件（尼康）研究了代表细胞中累积 ROS 的荧光强度的任何倍数变化。

NO的评估

我们使用或不使用 1 ng/mL AlNP 处理单培养的 EC 或星形胶质细胞 2 天，并使用一氧化氮指示剂 DAF-FM™ (ThermoFisher Scientific) 评估 EC 或星形胶质细胞释放的 NO 水平。 简而言之，用 PBS 和 10 μM DAF-FM™ 在 5% CO 中洗涤细胞 30 分钟₂ 细胞培养箱。 用PBS冲洗细胞3次，加入培养基，再孵育20分钟，以确保细胞中的二乙酸酯脱酯化。 最后，使用配备 FITC 滤光片的荧光显微镜实时评估 NO 的自发产生。 我们使用 NIS-Elements 软件分析了代表 NO 的荧光强度。

细胞衰老的评估

我们使用或不使用 1 ng/mL AlNP 处理单培养 EC 2 天，用 4% 多聚甲醛 (Biosesang Inc.) 在 RT 下固定细胞 15 分钟，并用补充有 0.1% v/v 的 PBS 洗涤细胞Tween®20 (PBST) 3 次。 接下来，将CellEvent™衰老绿色探针按1:1000的比例稀释到预热的CellEvent™衰老缓冲液（ThermoFisher Scientific）中，制备评估SA-β-gal活性的衰老检测溶液，立即对细胞进行处理。 样品避光，37°C，无CO条件下孵育2小时₂。 然后，弃去检测液，用PBS洗涤3次，并使用配备FITC滤光片的荧光显微镜捕获荧光图像。 使用NIS-Elements软件评估表明SA-β-gal活性的荧光强度。

免疫细胞化学

模型制备和AlNP处理完成后，我们用4%多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟，并用PBST洗涤3次。 对于细胞膜透化，用补充有 0.1% v/v Triton™-X 100 (Sigma-Aldrich) 的 PBST 在室温下处理细胞 15 分钟，并用 PBST 洗涤 3 次。 接下来，将细胞与补充有 2% v/v 牛血清白蛋白（BSA，Bovogen，墨尔本，维多利亚州，澳大利亚）的 PBST 在室温下孵育 1 小时以进行封闭。 用在封闭溶液中稀释的一抗以适当的工作稀释比例处理细胞，并在 4°C 下孵育过夜。 用 PBST 冲洗细胞 3 次，并与以 1:200 比例稀释在封闭液中的二抗以及 1% v/v Hoechst 一起孵育。 一抗和二抗的详细信息，包括稀释比例和其他信息，已在表中给出 S1 （支持信息）。 然后，用PBST洗涤细胞五次并通过荧光显微镜观察。 NIS-Elements 软件用于评估荧光强度。

H的评估₂氧₂

Amplex™ 红色过氧化氢检测试剂盒购自 ThermoFisher，用于检测 H 水平₂氧₂ 在条件培养基中。 收集样品，与H混合₂氧₂ 以 1:1 的比例配制溶液，然后在室温下避光孵育 30 分钟。 孵育后，使用酶标仪（Bio Tek Gen5）测量吸光度。

统计分析

所有统计数据均使用 GraphPad Prism 9 软件（Graphstats Technologies，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）计算为平均值±标准差。 简而言之，使用未配对的双尾 t 检验来比较统计显着性和 p< 0.05 被认为具有统计显着性。 ns、*、**、***、****等符号用于表示无意义， p< 0.05， p< 0.01， p< 0.001， p分别 < 0.0001。

荧光成像定量

使用尼康TiE显微镜拍摄荧光图像。 为了量化免疫细胞化学后代表标记的表达水平，在每张捕获的图像中随机选择大小均匀的感兴趣区域（ROI），然后通过 NIS-Elements 软件测量目标 ROI 的平均荧光强度。 评估接触面积（图 1） 1g)，我们通过Image J软件从VE-cad的荧光图像中选择单细胞外围边界的饱和区域。 我们还从相同的图像中选择了细胞的身体部位并分析了 EC 的大小（图 1）。 1h) 通过 NIS-Elements 软件。