研究人群
本研究是 CORDIOPREV 研究的一部分，该研究代表用橄榄油进行冠状动脉饮食干预和心血管预防研究（Clinicaltrials.gov 编号 NCT00924937）。 这项研究是在西班牙科尔多瓦的雷纳索非亚大学医院进行的。 该研究设计涉及单中心、随机、单盲和受控饮食干预。 总共纳入了 1002 名先心病患者，近期公布了有关基本原理、研究方法、纳入和排除标准、心血管危险因素以及患者基线特征的详细信息 [13]。 简而言之，符合条件的患者包括年龄在 20 岁至 75 岁之间的男性和女性，他们已确诊患有 CHD，在过去 6 个月内没有发生临床冠脉事件，能够遵循长期饮食干预，并且没有严重的冠心病症状。疾病或预期寿命低于研究时间。 年龄上限是根据试验开始时的预期寿命（2007年）设定的，符合当代长期心血管研究的通常做法。
所有参与者在参与研究之前均已获得书面知情同意书。 该研究方案遵循机构和良好临床实践指南，获得了雷纳索非亚大学医院人体研究审查委员会的批准。
CORDIOPREV 研究的主要目的是通过长期随访研究，评估地中海饮食与低脂饮食相比，在预防既往先心病患者的临床事件和死亡率方面的功效。 在这里，我们报告了 CORDIOPREV 研究的一项次要结果的结果：T2DM 发病率。 在这项研究中，我们纳入了 1002 名患者中的 462 名，这些患者在研究开始时尚未被诊断为 T2DM。 根据美国糖尿病协会 (ADA) 诊断标准，在这些基线时的非 T2DM 患者中，有 107 名患者发展为 T2DM（事件-T2DM） [14]中位随访 60 个月后。 在这项研究中，19 名患者被排除，因为我们没有他们的 TL 数据； 因此，最终样本由 338 个非 T2DM 和 105 个事件 T2DM 组成（附加图 1）。 1）。 每年，根据 ADA T2DM 标准评估 T2DM 发病率：空腹血糖≥126 mg/dL 或 75 g 口服葡萄糖耐量试验中 2 小时血糖≥200 mg/dL 或糖化血红蛋白 (HbA1c) 水平≥ 6.5% 。 在没有明确高血糖的情况下，诊断需要同一样本或两个单独测试样本的两次异常测试结果 [14]。
本子研究的样本量和功效计算基于以下假设：地中海饮食组 T2DM 发病率为 10%，低脂组为 17%，统计功效为 80% ，两条尾部的 α = 0.05。 根据这些假设并假设估计损失为 10%，我们从每个饮食干预组的 163 名患者中确定了必要的样本量。 在本研究中，所有基线时未被临床诊断为 T2DM 的受试者均被纳入其中（n = 462；216 例低脂饮食，246 例地中海饮食）。 该组中，所有 107 名患有 T2DM 的受试者均被纳入其中（42 名低脂饮食受试者，65 名地中海饮食受试者）。 其余 355 名受试者未诊断为 T2DM（174 名低脂饮食和 181 名地中海饮食）（附加图 1）。 1）。
随机化和掩蔽
随机化由安达卢西亚公共卫生学院进行（1:1 比例）。 营养师是干预小组中唯一了解每个参与者的饮食组的成员。 简而言之，随机化基于以下变量：性别（男性、女性）、年龄（< 60 岁和≥ 60 岁）和既往心肌梗塞（是、否）。 有关随机化的详细信息之前已报告和总结 [15]。
饮食干预
患者被随机接受两种不同的健康饮食模式之一：(1) 地中海饮食，其中至少 35% 的卡路里来自脂肪（22% 单不饱和脂肪酸、6% 多不饱和脂肪酸和 < 10% 饱和脂肪酸）、15% 蛋白质和最多 50% 的碳水化合物，以及 (2) 国家胆固醇教育计划推荐的低脂饮食，总脂肪含量 < 30%（12-14% 单不饱和脂肪酸、6-8% 多不饱和脂肪酸和 < 10% 饱和脂肪酸） ）、15% 蛋白质和至少 55% 碳水化合物。 在两种饮食中，胆固醇含量均调整为< 300 毫克/天。 本研究进行了五年的随访。 有关饮食的详细信息之前已报道和总结过 [15]。
患者在基线时接受营养师的单独面对面访谈，并每年完成一份包含 137 项的半定量食物频率调查问卷，该调查问卷先前在西班牙得到验证 [16]。 每年，包含 14 项的地中海饮食依从性筛查 [17] 用于测量对地中海饮食的依从性，并使用 9 项饮食筛选器来评估对低脂饮食的依从性。 此外，两个干预组都接受了相同的强化饮食咨询。 营养师在基线和每六个月进行一次个性化的一对一访谈。 此外，每季度举行一次集体教育会议，每次最多 20 名参与者，并为每个小组单独举行会议。
实验室测量
研究开始时禁食 12 小时过夜，随访期间每年一次，从参与者身上采集静脉血样本，放入 EDTA 管中（最终浓度为 0.1% EDTA），并将血浆与红色分离。在 4 °C 下以 1500 × g 离心 15 分钟，然后立即冷冻在 − 80 °C 下。 生化测量是由对干预措施不知情的人员在雷纳索非亚大学医院进行的。 使用 DDPPII Hitachi 模块化分析仪（Roche，巴塞尔，瑞士）使用特定试剂（Boehringer-Mannheim，曼海姆，德国）评估脂质变量。 通过酶法测定血浆甘油三酯和胆固醇浓度。 用硫酸葡聚糖-Mg2+ 沉淀血浆等份后，测量高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-c)。 低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-c) 浓度通过 Friedewald 方程计算，使用以下公式：LDL-c = 总胆固醇 – (HDL-c + 甘油三酯/5)。 通过己糖激酶方法进行葡萄糖测量。 高灵敏 C 反应蛋白 (hs-CRP) 通过 ELISA 技术测定（BioCheck, Inc., Foster City, CA, USA）。
从血液样本中分离 DNA
通过盐析法从血沉棕黄层部分中分离 DNA [18]使用 10 mL 蒙特利尔-巴尔的摩缓冲液（0.32 M 蔗糖、0.1 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.025 mM MgCl2、1% Triton X-100），混合并离心以分离核部分。 用 3 mL 核裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.2，2 mM EDTA，0.4 M NaCl）和 10% SDS 和蛋白酶 K 匀浆核沉淀。用 6 M NaCl 沉淀 DNA，并用 100 mL 洗涤液洗涤。 %乙醇。 最后，提取基因组 DNA 并重悬于 500 µL 1× TE 缓冲液中。 使用 NanoDrop ND-2000 (ThermoFisher, Waltham, MA) 通过分光光度法评估 DNA 纯度和浓度。
TL的定量PCR分析
TL 使用 Cawthon 方法通过 qPCR 测定 [19]。 对于所有样本，我们估计了针对单拷贝基因（智人核糖体蛋白 L13a 基因 RPL13a (S)）标准化的端粒重复拷贝数 (T) 的相对比率。 每个 PCR 的结果均与使用参考 DNA 样本构建的标准曲线相关。 端粒和 RPL13a 基因 PCR 的标准曲线由八个 DNA 参考标准品 (1–25ng) 组成。 所有 PCR 均使用 iQ5-BIORAD 热循环仪和 SensiFAST SYBR Lo-ROX 试剂盒（Bioline）进行。 端粒重复拷贝数的变异系数 (%CV) 为 9.32%，单拷贝基因拷贝数的变异系数为 6.76%。 两个扩增子的热循环仪曲线首先在 95°C 孵育 3 分钟以激活聚合酶，然后进行 40 个循环，其中 95°C 5 秒，54°C 15 秒。 除了寡核苷酸引物：20 ng 模板 DNA、1× SensiFAST SYBR Lo-ROX、200 nM 反向引物和 200 nM 正向引物外，反应混合物组成相同。 每个 PCR 反应的最终体积为 20 µL。 引物序列为（5′→3′）：
TeloFw，CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTT GGGTTTGGGTTTGGGTT； TeloRw，GGCTTGCCTTACCC TTACCCTTAACCCTTAACCCTTACCCT； RPL13aFw，CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA； RPL13aRw，TTGAGGACCTCTGTGTTTTGTCAA。
在基线和 4 年时间点进行 DNA 提取和 TL 测量。 虽然在其他时间点评估 TL 可以提供进一步有价值的见解，但我们在研究中没有观察到 4 年时间点 TL 的统计显着变化。 在这项工作中，我们评估了基线 TL 作为识别具有短 TL 风险（TL <百分位数 20）的个体的标记的作用。
统计分析
使用 STATA 14（STATA Corp.，TX，USA）进行统计分析。 我们对连续变量使用平均值和平均值的标准误差（平均值±SEM），对分类变量使用百分比。 所有 p 值均为 2 尾，p < 0.05 被认为具有统计显着性。
最短 TL（而非平均 TL）的定义与端粒功能障碍和细胞存活限制相关 [20, 21]。 通过这种方式，根据基线时 TL 短的风险对患者进行分类，如之前报道的那样，TL 低于 20 个百分位定义为 TL，高于 20 个百分位定义为无风险 [22,23,24]。
学生的未配对用于组间比较。 使用卡方检验比较分类变量。 我们使用 Fisher 精确检验来评估参与者的 T2DM 发病率与短 TL 风险之间的关系。 马赛克图已用于显示 T2DM 发病率与短 TL 风险之间的关系，其中条形高度代表短端粒风险高或低的参与者的比例，每个条形的宽度与 T2DM 发病率成正比。 根据端粒短的风险，运用Logistic回归模型评估T2DM的发病风险。 我们使用 Cox 比例风险回归来测试 TL 的潜在预测价值以及 TL 在选择饮食模型以降低患糖尿病风险方面的潜在作用。 此外，我们还进行了统计分析，以评估 Cox 回归模型中饮食组与短 TL 风险之间的相互作用。 回归分析根据年龄、性别、体重指数（BMI）、腰围（WC）、HbA1c、HDL-c、甘油三酯以及糖尿病和早期冠心病家族史进行调整。 作为附加分析，运行受试者工作特征曲线 (ROC) 分析，以评估 TL 对事件 T2DM 和非 T2DM 患者群体进行分类的潜力。 我们执行了两个模型：第一个模型基于临床变量（BMI、年龄、性别、甘油三酯和他汀类药物的使用），第二个模型添加了 TL。
2024-03-16 18:31:46
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