患者和血浆样本
本回顾性研究纳入 2020 年 3 月至 2022 年 10 月期间在唐山工人医院接受肿瘤切除或初次减灭手术的 78 例 EOC 患者。 纳入标准如下：所有患者均为国际妇产科联合会（FIGO）I-IV期初诊EOC且适合手术治疗的患者。 对疑似早期 OC（I 期或 II 期）进行分期手术，以确定分期并切除癌症。 对于晚期 OC（III 期或 IV 期），癌症已广泛扩散，需进行减瘤或细胞减灭手术以切除所有可见的癌症 [22]。 所有患者均经术后病理检查确诊为EOC。
此外，该研究还纳入了 40 名年龄匹配的上皮性良性卵巢肿瘤患者（19 名良性浆液性囊腺瘤、11 名粘液性囊腺瘤、6 名腺泡细胞瘤和 4 名成熟畸胎瘤）和 52 名健康对照（HC）。 术前接受过抗肿瘤治疗的 EOC 患者被排除在研究之外。 健康志愿者没有任何肿瘤或其他免疫和代谢疾病。 所有参与者都获得了使用其血液样本的书面知情同意书。 本研究经唐山市工人医院机构研究伦理委员会批准。
将每位参与者的血样 (10 mL) 收集到血浆分离管中，并在一小时内进行处理。 通过在 4°C 下以 2000×g 离心 10 分钟来去除活细胞和细胞碎片来获得血浆。 收集上清液并储存在-80°C以供进一步分析。
血浆外泌体分离
使用先前描述的超速离心方法提取血浆外泌体 [23]。 简而言之，将血浆在 4°C 下解冻，并在 3000×g 下离心 10 分钟以去除碎片。 然后使用超速离心机（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）将上清液在 4°C 下以 10,000×g 超速离心 30 分钟。 随后，在 4°C 下以 100,000×g 进行另一个超速离心步骤 120 分钟以富集外泌体。 将沉淀物用 20 mL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤，并在 4 °C 下以 100,000 x g 超速离心 120 分钟收集。 重悬于 PBS 中后，将外泌体储存在 -80°C 下以供进一步分析。
透射电子显微镜 (TEM)
外泌体沉淀在 4°C 解冻并重悬于 PBS 中。 将 20 µL 悬浮液置于直径为 2 nm 的碳涂层铜网格上。 用滤纸吸干后，用1%戊二醛固定样品5 min。 然后用 ddH2O 洗涤网格五次，并在室温下用 3% 磷钨酸负染 3 分钟。 用 ddH2O 洗涤 3 次，每次 15 分钟后，将网格在室温下在空气中干燥 5-10 分钟。 在透射电子显微镜（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）下观察外泌体并拍照。
蛋白质印迹分析
用放射免疫沉淀裂解缓冲液（Beyotime，江苏，中国）裂解A2780细胞和血浆来源的外泌体，并在4℃下以12,000×g离心15分钟获得总蛋白。 使用二辛可宁酸 (BCA) 蛋白质检测试剂盒 (Beyotime) 进行定量后，通过 SDS-PAGE 分离等量的细胞和外泌体蛋白质，并转移至 PVDF 膜 (Millipore, Billerica, MA, USA)。 将膜用含有 0.1% Tween 20 (TBST) 的 Tris 缓冲盐水中的 10% 脱脂牛奶封闭 1 小时，然后在 4°C 下与一抗（包括抗 GM130（Abcam ab52649；1:1000））一起孵育过夜，抗 HSP70（Abcam ab2787；1:1000）和抗 CD9（Abcam ab236630；1:1000）。 用 TBST 洗涤 3 次后，将膜与适当的 HRP 标记的二抗一起孵育：山羊抗兔 IgG H&L (HRP) (Abcam ab97051; 1:2000) 或山羊抗小鼠 IgG H&L (HRP) (Abcam ab205719; 1:2000)。 1:2000），视情况，在室温下放置 1 小时。 最后，使用 BeyoECL Plus 化学发光试剂盒（Beyotime）和电化学发光系统（PerkinElmer Life Science，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）在照相胶片上可视化蛋白质条带。
外泌体 miRNA 提取、逆转录和实时定量聚合酶链反应 (RT-qPCR)
使用 miRNeasy Micro 试剂盒（Qiagen，希尔登，德国）按照制造商的方案提取总外泌体 miRNA。 RNA 的质量和数量使用 Agilent Bioanalyzer 2100 系统（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）根据制造商的标准程序进行测定。 通过 RT-qPCR 评估外泌体 miR-223 的定量。 首先，按照制造商的说明，使用 miScript II RT 试剂盒（Qiagen）和 Hispec 缓冲液将总外泌体 miRNA 逆转录为 cDNA。 简而言之，成熟的 miRNA 通过聚腺苷酸聚合酶进行聚腺苷酸化，并使用寡聚 dT 引物反转录成 cDNA。 聚腺苷酸化和逆转录在同一管中平行进行。 oligo-dT 引物具有 3′ 简并锚定点和 5′ 端通用标签序列，允许在实时 PCR 步骤中扩增成熟 miRNA。 根据制造商的说明，使用目标特异性 miScript Primer Assays 和 miScript SYBR Green PCR 试剂盒进行 cDNA 扩增，其中包含 miScript Universal Primer（反向引物）和 QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)。 靶标特异性引物如下：miR-223正向，5′-AGCCGTGTTCAGTTTGTCAAAT-3’； 反向，5′-GTGCAGGGGTCCGAGGTC-3’； U6 正向，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。 用于 miR-223 和 U6 的 qPCR 检测的 20 µL 反应系统包含 10 µL 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、2 µL 10x miScript Universal Primer（反向引物）、2 µL 10x miScript Primer Assay（特异性正向引物）、 4 µL dH2O 和 2 µL cDNA。 qPCR条件如下：在CFX-96实时上95℃预变性10分钟，然后进行40个循环的95℃变性15秒和60℃退火/延伸60秒PCR检测系统（Bio-Rad）。 以小核RNA U6（U6 snRNA）为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对定量，其中ΔCt=Ct [miRNA] – CT [U6]。
血浆 CA125 定量
按照制造商的说明，使用市售 ELISA 试剂盒（R&D Systems）对血浆 CA125 水平进行定量。 简而言之，向 96 孔条板的每个孔中添加 100 µL 测定稀释剂 RD 1X 后，向每个孔中添加 100 µL 标准品、对照或 2 倍稀释 EDTA 血浆，并将板孵育 2 小时室温下在水平轨道微孔板摇床上。 每孔洗涤四次后，向每孔中加入 200 µL Human CA125 Conjugate，并在摇床上室温孵育 2 h。 然后，每孔加入 200 µL 底物溶液，室温避光孵育 30 分钟。 最后，向每个孔中添加 50 µL 终止溶液。 使用设置为 450 nm 的酶标仪在 30 分钟内测定每个孔的光密度 (OD)。 根据标准曲线计算CA125浓度。
统计分析
使用SPSS20.0（IBM，芝加哥，伊利诺伊州，美国）和GraphPad Prism 9（GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）进行统计分析。 除非另有说明，数据以平均值±标准差（SD）表示。 使用单因素方差分析来分析两组以上之间的比较。 p 值 ≤ 0.05 被认为具有统计显着性。 进行Spearman相关分析和线性回归来测试血浆外泌体miR-223和血浆CA125之间的相关性。 采用受试者工作特征（ROC）曲线分析和曲线下面积（AUC）评估血浆外泌体miR-223、CA125及其组合的诊断价值。 使用 Youden 方法确定 EOC 诊断中外泌体 miR-223 和 CA125 的截止值，选择 Youden 指数（敏感性 + 特异性 – 1）最大化的截止点。
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2024-03-02 06:48:56
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