非 HIV 感染者的耶氏肺孢子菌肺炎

介绍

耶氏肺孢子虫 肺炎（PJP）是由感染引起的急性或亚急性肺炎 耶氏肺孢子虫 （八打灵再也）。 它最初可能导致呼吸困难、发烧和干咳，严重时可能导致死亡。1 作为一种机会性感染，它发生在免疫功能低下或受损的宿主中，是人类免疫缺陷病毒 (HIV) 最常见的并发症之一。 它还经常侵入患有血液恶性肿瘤、造血干细胞移植、自身免疫性疾病、炎症性疾病和免疫抑制治疗的非艾滋病毒免疫功能低下患者。2 近几十年来，由于常规使用化学预防和抗逆转录病毒治疗，HIV 感染患者中 PJP 的发病率和死亡率有所下降。3 相比之下，非HIV感染者中PJP的发病率显着增加。4 研究表明，HIV感染者的PJP死亡率低于10%，而非HIV感染者的PJP死亡率高达25%～55%。5 PJP的延误诊断和治疗将影响患者的预后，给家庭和社会带来巨大的经济负担。 因此，应尽早开展PJP的病原鉴定和临床干预，这对于降低患者死亡率、改善患者预后至关重要。

随着宏基因组下一代测序（mNGS）技术的出现，病原体检测方法日益多样化。 mNGS是指利用高通量测序和生物信息学分析技术，对从不同类型临床样本中提取的所有微生物核酸进行基因测序。 它可以高效、客观、准确地获取样本中的全部微生物信息，为识别病原感染提供新的手段。9 目前，绝大多数mNGS研究集中于细菌感染的诊断和治疗，而很少关注真菌感染的诊断和治疗，尤其是非HIV感染的PJP。 为此，我们专门设计了本研究来探讨mNGS在非HIV感染者PJP诊断和治疗中的价值。

材料和方法

科目

本回顾性研究选取2022年8月至2024年12月在新疆维吾尔自治区人民医院诊断的非HIV感染PJP患者和非PJP患者作为研究对象。 选择42例未感染HIV的PJP患者作为病例组，选择同期入院且随后诊断为非PJP的46例肺部感染患者作为对照组。 非 HIV 感染 PJP 患者的纳入标准：(1) 耶氏肺孢子虫 在下呼吸道标本中检出；10 （2）免疫功能低下患者，包括但不限于血液病、风湿性结缔组织病、长期使用皮质类固醇或免疫抑制剂、实体器官移植、实体瘤等； （三）确诊为非艾滋病毒感染者； (4) PCR检测PJ核酸阳性或mNGS检测PJ基因序列阳性者。 PJP 或非 PJP 的临床复合诊断由两位经验丰富的临床医生共同做出。 非PJP患者的纳入标准：（1）有发热、呼吸困难、咳嗽、咳痰等呼吸道症状的患者； (2)患者影像学表现为苍白斑片状阴影，密度增高，边缘模糊，也可表现为斑片状实变影或毛玻璃影； （3）PJ核酸PCR检测阴性，PJ基因序列mNGS检测阴性； (4)痰培养或支气管肺泡灌洗液标本产生明确的病原体。 排除标准如下：（1）重要病例数据缺失的患者； （二）有其他场所感染的； （三）年龄<18周岁的； (4) HIV合并感染者。 本研究经我院伦理委员会批准。 所有患者或家属都签署了知情同意书，这是根据《伊斯坦布尔宣言》进行的，所有器官都是自愿捐献的，并有书面知情同意书。

研究方法

用于 mNGS 检测的样品处理和 DNA 提取

将酶和 100 g 0.5 mm 玻璃珠添加到取出的 600 μL 样品中，并涡旋 30 分钟 [(1200–1500) × g]; 然后，将300μL摇匀的上清液转移至1.5mL离心管中用于核酸提取。 取3～5毫升抗凝静脉血样本，4℃、1600g离心10分钟，将血浆转移至2mL离心管中进行DNA提取。 使用华大核酸提取试剂盒提取DNA。

DNA 文库构建和测序

使用MGIEasy Cell-free DNA Library Prep Set（批号：108420230）通过DNA片段化、末端修复和PCR扩增构建DNA文库。 该技术通过DNA降解和环化将双链DNA转化为单链环状DNA，然后将合格的DNA加载到芯片上。 DNA文库纳米球使用MGISP-100自动化样品制备系统制备。 配制后测定浓度进行质量控制，要求≥8ng/ul。 将合格浓度的纳米球、纳米球加样缓冲液和纳米球聚合酶混合液配置成加样系统，与测序载玻片一起放入MGISEQ-2000平台进行基因测序。

生物信息学分析

基因测序结果是初步数据，还需要进一步处理。 首先，去除低质量数据和reads长度小于35bp的数据，获得高质量数据。9 使用 Burrows-Wheeler Aligner 软件 (BWA: http://bio-bwa.sourceforge.net/），然后删除含有宿主人类核酸序列的数据。 去除低复杂度序列后剩余的数据与专用微生物数据库进行比对，并将测序数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫进行分类和排列。 分类参考数据库可以从NCBI（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/）下载。 至于解释mNG的阈值标准，采用微生物物种特异性读数（SSRN）方法来解释测序结果。 为了 耶氏肺孢子虫本研究采用SSRN，即Pj读数≥1作为阳性标准，以保证敏感性。

数据采集

收集患者的基本信息（人口统计学、临床症状、基础疾病等）、实验室指标、BALFmNGS、PCR、血清BDG等。

统计分析

本研究收集的所有数据均使用SPSS 26.0软件进行统计分析，并使用GraphPad 8.0进行绘图。 符合正态分布的计量数据以均数±标准差（x±s）表示，独立样本 t-检验用于两组之间的比较。 非正态分布的测量数据以中位数（四分位间距）表示 [M (P25, P75)]和曼惠特尼号 U-检验用于两组之间的比较。 计数资料以频数（%）表示， H组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。 进行临床复合诊断（是否 耶氏肺孢子虫 下呼吸道标本中检测到）作为参考标准，10 计算敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV），P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

临床数据

本研究共纳入89例非HIV感染者，其中男性57例（64.04%），女性32例（35.96%），年龄22~83岁，平均年龄58.34±17.44岁。 大多数患者以呼吸困难为主要症状（69.66%），以实体恶性肿瘤（20.22%）为最常见的基础疾病。 实验室检查显示淋巴细胞计数中位绝对值为0.41×109/L，CD4+T淋巴细胞计数中位为117.0/L，均低于正常参考范围下限。 看 表格1 了解详情。

以临床复合诊断为参考标准，mNGS检测的灵敏度、特异度、阴性预测值、阳性预测值均为100%，PCR检测分别为90.48%、91.49%、90.48%、91.49%， BDG检出率分别为73.81%、80.85%、77.50%和77.55%。 可见mNGS的诊断效率明显高于PCR检测和血清BDG检测（表2）。

42例非HIV感染的PJP患者接受mNGS和常规BALF病原菌检测后，其中6例（14.29%）为单纯PJ感染，36例（85.71%）为合并PJ感染。 mNGS在混合感染中的检出率显着高于常规病原检测（85.71 vs 61.70%，P = 0.012）（表3）。 混合感染中，以真菌与细菌、病毒联合感染最为常见（20例）（图1）。

42例非HIV感染的PJP患者中，mNGS在肺泡灌洗液中检出127种病原体，其中真菌检出率最高（46.46%）。 检测到的真菌主要是 耶氏肺孢子虫 （42 例）和 白色链球菌 （8例）（图2）。 检测到的主要细菌是 鲍曼不动杆菌 （6 例）和 金黄色葡萄球菌 (4 例) (图3）。 检测到的病毒主要是人类伽马疱疹病毒4型（12例）和人类乙型疱疹病毒5型（8例）（图4）。

耶氏肺孢子虫 是一种机会性致病真菌，通过呼吸道进入肺部，多表现为无症状感染。 如果不及时治疗，很容易发展为急性呼吸窘迫综合征，这也是艾滋病患者死亡的主要原因之一。11 鉴于宿主对PJ的免疫反应可能存在差异，PJP在HIV感染者中是一个相对惰性的过程，通常发展为亚急性或慢性病程。 相比之下，非HIV感染者的PJP多为急性，肺部病变进展快，呼吸衰竭风险高，死亡率高。12 柯等人13 研究发现，延迟开始特异性抗感染治疗或最初不成功的抗菌治疗会导致非 HIV 感染的 PJP 患者出现急性呼吸衰竭，且预后不良。 PJP 的快速诊断和早期开始治疗可带来更好的预后。

PJ由于患者呼吸道接种量低，诊断困难，直接涂片镜检通常呈阴性。14 目前PJP的微生物学诊断中首选PCR和血清BDG两种检测技术。 尤其是PCR技术可以定量检测呼吸道分泌物中的PJ。 本研究发现PCR具有较高的敏感性(90.48%)和特异性(91.49%)。 萨尔泽等人15 结论认为PCR检测BALF中PJ的敏感性为94%-99%，特异性为89%~91%，与本研究结果一致。 然而，PCR 在 PJP 的诊断中存在局限性。 污染、定植等可能导致假阳性结果。 研究表明，定量 PCR (qPCR) 似乎可以提高诊断效率，但对于区分 PJ 定植与感染所需的阈值存在争议。16 此外，尽管PCR对单一感染的检测价值较高，但在单一感染混合感染的检测中价值有限。 相比之下，mNGS对PJP的诊断效率更高，对混合感染的诊断价值更高。 当常规抗感染治疗无效且考虑混合感染时，mNGS是一个不错的选择。 BDG是多种病原真菌细胞壁合成过程中产生的结构多糖。 目前主要用于肺部侵袭性曲霉菌病和侵袭性念珠菌病的辅助诊断。17 号 近年来的几项观察性研究描述了使用 BDG 检测来推定诊断 PJP。 研究表明，BDG检测可作为无创性纤维支气管的PJP推定诊断的微创筛查试验。18 但BDG在诊断PJP时容易出现假阳性结果，导致诊断终止（在阳性结果的情况下，一般不终止诊断），尤其是重症患者。 因此，在进行BDG检测时需要进一步进行验证性测试。19 mNGS优于BDG的是，它具有更好的诊断性能，可以快速、客观、无偏见地识别病原微生物。

MNGS是一种新型微生物检测鉴定技术，与传统检测技术相比，能够快速、公正、客观地鉴定病原微生物。 在未知病原、难培养病原、条件病原、混合病原感染和疑难感染的早期诊断方面具有明显优势，为精准抗感染治疗提供了新手段。20 然而，目前尚无关于 mNGS 在 PJP 中的诊断性能的完整知识。 本研究中，mNGS在非HIV感染的PJP患者中的敏感性和特异性均为100%，明显优于血清BDG和PCR检测。 这些结果表明mNGS的早期应用有利于促进PJP的快速、准确诊断。 此外，mNGS对BALF中混合感染的检出率显着高于常规病原体检测，提示mNGS在识别PJP混合感染患者的共病原体方面具有优势。 这与Duan等人的研究结果一致。21 李等人的更多研究10 探讨mNGS对艾滋病合并PJ感染的诊断价值，结果显示mNGS检测符合率为100%。 这与本研究的结果是一致的。 本研究中，mNGS技术不仅用于检测目标病原体，还用于检测其他病原体的混合感染，其中以疱疹病毒的混合感染最为常见。 同时，细菌、病毒和真菌的感染也很常见，可为有效的抗感染治疗提供指导。

本研究仍存在一定的局限性：这是一项单中心研究，患者组选择存在偏差； 此外，这也是一项样本量有限的回顾性研究。 针对这一点，需要进一步的前瞻性研究来证实mNGS在非HIV患者PJP感染诊断和治疗中的应用价值。

结论

综上所述，与血清BDG和PCR检测相比，mNGS在非HIV感染PJP的诊断中具有明显优势，其检测速度快、报告时间短、灵敏度和特异性高、混合感染检出率高。 对于临床早期诊断、指导针对性治疗具有一定价值。

数据共享声明

当前研究中使用和分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。

道德批准和参与同意

本研究根据赫尔辛基宣言进行，并经新疆维吾尔自治区人民医院研究伦理委员会批准。 由于回顾性研究的性质和匿名患者信息，经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准，放弃知情同意。 所有方法均按照相关指南和规定进行。

作者贡献

资金

NGS技术诊断的研究 耶氏肺孢子虫 非 HIV 感染患者的肺炎 (20220104)。

披露

所有作者均不存在任何个人、财务、商业或学术利益冲突。

参考

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