介绍
图S1）。 慢性间歇性缺氧的模式和时间与CIH组相同。
细胞活力测定
我们使用细胞计数试剂盒8检测（CCK-8）（Beyotime，C0037，中国）来测试细胞活力。 将ROAEC添加到96孔板中，每组5个多孔板。 成型后，每孔加入10μL CCK-8溶液。
37℃孵育2h后，用酶标仪在450nm处检测吸光度。 结果按下式计算：（实验组-空白对照）/（阴性对照-空白对照）×100%。
细胞凋亡检测
CIH模型后，将细胞收集于1.5 mL ep管中，用PBS洗涤三次，然后重悬于200ul含10 µL PI和5 µL Annexin V-FITC（Beyotime，C10625，中国）的结合缓冲液中。 室温孵育10分钟后，C6流式细胞术检测细胞凋亡率。
ROS检测
通过ROS测定（Beyotime，S00335，中国）测量ROS水平。 将ROAEC种植在6孔板中。 CIH 建模后，将细胞收集到 1.5 mL ep 管中。 将 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 添加到每个 ep 管中。 37℃培养箱中孵育20分钟后，用无血清DMEM洗涤细胞3次，用无血清DMEM悬浮，并进行流式细胞仪检测。
细胞内 Fe2+ 水平的检测
使用FerroOrange（F-374，同仁岛，中国）检测不同组的Fe2+水平。 将细胞收集到 1.5 mL EP 管中，用无血清 DMEM 洗涤，然后在 37°C 培养箱中用 1 µM FerroOrange 孵育 30 分钟，并通过流式细胞仪进行测试。
丙二醛 (MDA) 测定
为了评估 MDA 水平，使用了 MDA 检测试剂盒。 将细胞接种在 10 cm 培养皿中，并在建模过程后收集在 5 mL EP 管中。 根据制造商的说明，制备样品和试剂。 然后通过酶标仪测量 532 nm 和 600 nm 处的吸光度。 随后，使用标准曲线计算MDA水平。
脂质过氧化的测量
将细胞接种到 6 孔板中。 CIH造模后，将细胞收集于1.5EP管中，用无血清DMEM洗涤3次。 然后在 1 µM 4.4-二氟-5-(4-苯基-1,3-丁二烯基)-4-bora-3a,4a-二氮杂-indacene-3-十一烷酸 (C11-BODIPY 581/591) 中孵育（ Thermo Fisher，美国）在 37°C 培养箱中培养 30 分钟。 无血清DMEM洗涤3次，流式细胞仪检测。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）/NADH比值检测
使用带有 WST-8 (Elabscience) 的 NADP+/NADH 测定试剂盒检测 NAD+/NADH 比率。 将细胞接种在6孔板中，用预冷的PBS洗涤，并收集在1.5 EP管中。 按照说明准备样品和试剂，然后将样品和试剂添加到标记板中。 对于 NADH 检测，样品应在 60°C 下孵育 30 分钟以去除 NAD+。 37℃孵育30分钟后，用酶标仪在450nm处检测吸光度。 使用标准曲线计算 NAD 总和 NADH。 NAD+/NADH比率=(NAD总-NADH)/NADH*100%。
代谢物分析
每组收集2*107个细胞。 离心后，将细胞保存在液氮中30s并保持在-80℃。 立即提取代谢物，并对中心碳代谢进行靶向代谢组学分析。 加入500 μL预冷的MeOH/H2O（3/1，v/v）后，将样品在干冰中预冷，并在液氮中重复冻融3次； 收集 400 μL 等份的澄清上清液并通过旋转干燥。 然后，用200μL纯化水复溶样品。 重构的样品在通过离心管过滤器过滤之前进行涡旋，随后转移到注射瓶中的插入物中以进行 HPIC-MS/MS 分析。 使用配备 Dionex IonPac AS11-HC (2×250 mm) 和 AG11-HC (2 mm×50 mm) 色谱柱的 Thermo Scientific Dionex ICS-6000 HPIC 系统（Thermo Scientific）进行 HPIC 分离。 采用配备电喷雾电离 (ESI) 接口的 AB SCIEX 6500 QTRAP+ 三重四极杆质谱仪 (AB Sciex) 进行检测开发。 使用热图R包（corrplot）（版本0.89）来分析中心碳代谢的热图。
实时荧光定量PCR
使用总RNA分离试剂盒V2（Vazyme，中国）提取RNA。 使用 HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR（Vazyme，R333-01，中国）对 cDNA 进行反转录。 RT-qPCR 在 (ABI QuantStudio 5) ABI 7500 热循环仪（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）上使用 SYBR Green PCR Master Mix（Vazyme，Q712，中国）进行。 检测到 GPX4 和 SLC7A11。 表格1 显示适当的引物。 通过2-Δ(CT)法计算mRNA的相对表达水平。
表格1 PCR引物序列
蛋白质印迹法
使用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（Beyotime，中国）提取蛋白质。 采用BCA蛋白浓度试剂盒（Beyotime，中国）检测蛋白浓度。 然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（美伦生物，中国）分离蛋白质。 电泳将蛋白质分子转移到膜上（Millipore, 150 Billerica, MA, USA）。 然后，将膜浸泡在5％脱脂奶粉中，并溶解在Tris Buffer Solution Tween（TBST）（servicebio，G0001-2L，中国）中2小时。 一抗 SLC7A11（溶质载体家族 7 成员 11，Abcam，ab175186，1:1000）、GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶 4，Abcam，ab252833，1:1000）和 β-肌动蛋白（Abcam，ab5694，1:1000）然后在 4°C 下孵育过夜。 TBST洗膜后，与羊抗兔IgG二抗(Abcam，ab205718，1:10,000)室温孵育1 h，然后用TBST洗3次。 一些印迹在浸泡在抗体中之前被分开。 借助改进的ECL试剂盒（Meilunbio，MA0186-1，中国），图像由Image J拍摄和分析。
透射电子显微镜
造模后弃去培养基，加入电镜固定液，4℃培养2~4h，低速离心后收集细胞。 将样品包埋在 1% 琼脂糖中，并用 0.1m 磷酸盐缓冲液冲洗三次，每次 15 分钟。 然后在室温下将它们固定在 1% 锇酸和 0.1m 磷酸盐缓冲液混合物中。 然后用0.1m磷酸盐缓冲液冲洗三次，每次15分钟。 样品依次用30-50-70-80-95-100-100%乙醇室温脱水15 min，100%丙酮室温脱水两次，每次15 min。 包埋后，将超薄切片切成70nm，用柠檬酸铅染色，并用透射电子显微镜（Hitachi，HT7700，日本）拍照。
线粒体膜电位的检测
JC-1法（Beyotime，C2006，中国）用于测试线粒体膜电位（MMP）。 按照说明书配制JC-1工作液，每组加入500 μL，混匀，37℃孵育20 min。 300g/min离心5分钟后，滴去上清，用预冷的1*JC-1 Assay Buffer洗涤两次。 用1*JC-1 Assay Buffer重悬细胞，然后用流式细胞仪检测。
统计分析
结果全部显示为平均值±标准差。 使用GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software Inc.，美国）进行统计分析。 学生-t两组间采用-检验进行统计学分析，P<0.05为有统计学意义。
结果
CIH 诱导的 ROAEC 损伤和铁死亡
CIH条件下暴露36 h后，检测细胞凋亡率、ROS水平、Fe2+水平、脂质ROS水平、MDA水平（图1A-D，图1H）与对照组相比显着增加（p < 0.05）。 CIH 暴露 36 小时后，ROAEC 的细胞活力和 NAD+/NADH 比率显着降低（图1E 和 我）（p < 0.05）。 与对照组相比，CIH组GPX4和SLC7A11的mRNA和蛋白水平显着下降，均p < 0.05，如图所示 图1F-G。 原始蛋白质印迹图像如图 S2 所示。
图1 CIH 诱导的 ROAEC 损伤和铁死亡。 （A)、CIH组和对照组的细胞凋亡率； （乙）、CIH组和对照组ROS水平； （C)、CIH组和对照组的Fe2+水平； （D)、CIH组和对照组脂质ROS水平; （乙），CIH组和对照组ROAEC细胞活力下降； （F)、CIH组和对照组GPX4、SLC7A11 mRNA水平； （G)、CIH组和对照组GPX4和SLC7A11蛋白水平; （H)、CIH组和对照组的MDA水平； （我)、CIH组和对照组的NAD+/NADH比值。 数据重复至少三次并显示为平均值±SD。 *p<0.05； **p < 0. 01; ***p < 0. 001; ****p < 0.0001.
Fer-1 减轻 CIH 相关的 ROAEC 损伤和铁死亡
CIH和Fer-1联合处理后，细胞凋亡率、ROS水平、Fe2+水平、脂质ROS水平、MDA水平（图2A-D，图2H）减少； 而细胞活力和NAD+/NADH比值较CIH组有所增加（图2E、图2I）（所有 p < 0.05）。 在CIH+Fer-1组中，与CIH组相比，GPX4和SLC7A11的mRNA和蛋白水平增加（图2F-G）（均 p < 0.05）。 原始蛋白质印迹图像如图 S3 所示。
Fer-1 减轻 CIH 诱导的线粒体结构和功能损伤
为了观察线粒体的结构和功能，我们进行了TEM和MMP检测。 TEM结果显示，与对照组相比，CIH组线粒体膜受损，并出现基质溢出现象（图3A）。 JC-1检测结果显示，CIH组MMP低于对照组（图3B）。 与Fer-1共同治疗后，CIH引起的线粒体结构和MMP损伤被逆转（图3C-D）。
图3 Fer-1 减轻了 CIH 治疗的 ROAEC 中的线粒体损伤。 （A），对照组和CIH组的透射电镜（TEM）照片； （乙），对照组和CIH组线粒体膜电位（MMP）水平。 （C）、对照组、CIH组、CIH+Fer-1组的TEM照片。 （D)、对照组、CIH组、CIH+Fer-1组的MMP水平。 数据显示为平均值±SD。 与对照组相比，**p < 0. 01； 与 CIH 组相比，####p < 0. 0001。
Fer-1 缓解 CIH 诱导的线粒体代谢紊乱
图4 Fer-1 改善了 CIH 诱导的 TCA 循环代谢异常。 对照组和 CIH 组中中心碳代谢显着调节代谢物的层次聚类（n = 6，生物重复）。（A) 色标表示相对代谢物水平：红色表示上调，蓝色表示下调。 （乙), TCA 循环中代谢物改变的示意图。(C），对照组、CIH组和CIH+Fer-1组中中心碳代谢显着调节的代谢物的层次聚类（n = 6，生物重复）。 色标表示相对代谢水平：红色表示上调，蓝色表示下调。 （D），CIH 增加了 TCA 循环中代谢物的水平。 Fer-1治疗减轻了CIH引起的代谢物的增加。 数据显示为平均值±SD。 与对照组相比，**p < 0. 01，***p < 0. 001，****p < 0. 0001； 与 CIH 组相比，### p < 0. 001，####p < 0. 0001。
三羧酸（TCA）循环是位于线粒体基质中的酶途径。 筛选出TCA循环中差异表达的关键代谢物，如图所示 图4B。 比较各组中α-酮戊二酸（αKG）、琥珀酸、富马酸、苹果酸、2-氧代丁酸和顺乌头酸的表达水平。 CIH 暴露增加了 TCA 循环中的代谢物水平。 与 CIH 组相比，Fer-1+CIH 组的 TCA 循环中的代谢物水平降低，如图所示 图4D （所有 p < 0.05）。
讨论
目前的研究表明，CIH 暴露会导致 ROAEC 铁死亡。 铁死亡抑制剂Fer-1可有效抑制这种损伤。 此外，在 CIH 处理的 ROAEC 中，线粒体形态、功能和 TCA 循环中的代谢物发生了变化，而 Fer-1 可以逆转这种变化。
图5 Fer-1 逆转 CIH 诱导的主动脉内皮细胞铁死亡的可能分子机制。 在ROAEC中，CIH处理后，TCA循环中重要代谢产物的活性增加，导致脂质ROS的积累、线粒体膜电位的变化以及线粒体结构的破坏，最终导致铁死亡。 与 Fer-1 共同治疗可通过重新编程 TCA 循环的代谢物和线粒体功能来逆转铁死亡。
这项研究存在一些局限性。 该研究仅限于细胞实验。 体外和体内研究的结果可能存在一些差异。 因此，我们今后将通过动物实验来证实Fer-1在CIH相关心血管损伤中的作用。
结论
CIH 诱导的 ROAEC 铁死亡。 Fer-1逆转了TCA代谢物的水平，然后减少了ROS的积累和线粒体结构的破坏，最终逆转了ROAEC中CIH诱导的铁死亡的发生。
缩写
OSA，阻塞性睡眠呼吸暂停； CIH，慢性间歇性缺氧； Fer-1，铁他汀-1； ROAEC，大鼠动脉内皮细胞； SLC7A11，胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11； GPX4、谷胱甘肽过氧化物酶4； CCK-8，细胞计数试剂盒-8； ROS，活性氧； COPD，慢性阻塞性肺疾病； DMEM，杜尔贝科改良伊格尔培养基； DCFH-DA，2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯； TEM、透射电子显微镜； RIPA，放射免疫沉淀分析； SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳； TBST，Tris 缓冲液吐温； PBS，磷酸盐缓冲盐水； TCA，三羧酸循环； MMP，线粒体膜电位； αKG，α-酮戊二酸； NAD+，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸； MDA、丙二醛； C11-BODIPY 581/591，4,4-二氟-5-(4-苯基-1,3-丁二烯基)-4-bora-3a,4a-二氮杂-indacene-3-十一烷酸； PPP，戊糖磷酸途径。
数据共享声明
本研究使用的数据可通过通讯作者获得。
资金
该研究得到了福建省自然科学基金项目（编号：2023J01554）、福建省财政联合基金项目（编号：BPB-LNF2021）、国家自然科学基金项目（编号：82170101）的资助。
披露
作者报告在这项工作中没有利益冲突。
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#CIH诱导大鼠动脉内皮细胞铁死亡
