NK 在 MDS 中的预后意义

背景

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组来源于造血干细胞的异质性髓系克隆性疾病，以无效造血为特征，表现为造血细胞形态异常和外周血细胞减少，MDS 有很高的转化为继发性急性髓系白血病（AML）的风险。1 由于预后的异质性，目前MDS患者的临床治疗计划主要依赖于各种临床预测模型提供的风险分层。2 2012 年，引入修订的国际预后评分系统 (IPSS-R) 对 MDS 患者进行风险分层。3 评估方法主要侧重于血细胞减少的程度（贫血、血小板减少、中性粒细胞减少、血红蛋白水平降低）、骨髓原始细胞增多和细胞遗传学因素。在最近的研究中，研究人员广泛研究了 MDS 的几种潜在预后预测因素。我们的研究团队发现，血清中 ApoA1 水平较低、纤维蛋白原水平升高以及骨髓中成熟单核细胞增多都与 MDS 预后不良有关。4–6

宿主免疫失调参与了MDS的发生、发展。7 淋巴细胞是体内重要的免疫细胞，发挥细胞免疫作用和免疫调节功能。它们还在宿主体内发挥免疫监视作用，并积极参与机体的造血过程。值得注意的是，绝对淋巴细胞计数 (ALC) 水平与预后有相关性，表明其可用作生物标志物。8 淋巴细胞亚群检测是评估淋巴细胞质量和数量的主要方法，近年研究表明外周血淋巴细胞亚群可用于预测乳腺癌、肾细胞癌的预后。9，10 但目前淋巴细胞亚群在MDS疾病进展和预后中的作用尚缺乏证据，因此我们对诊断时的淋巴细胞亚群进行了回顾性分析，以准确判断其对MDS患者有意义的预后价值。

材料和方法

患者

宁波大学附属第一医院伦理委员会（批准号 RS2023142A）根据《赫尔辛基宣言》批准对这些记录进行回顾性审查。所有成年受试者均已获得知情同意，如果受试者未满 18 岁，则还需获得其父母的知情同意。

淋巴细胞亚群检测

所有受试者采集外周血样本，用EDTA抗凝。淋巴细胞亚群计数采用BD FACSCanto流式细胞仪（美国BD公司）。淋巴细胞亚群计数采用BD Multitest 4-Color TBNK试剂。本研究使用的抗体包括CD45 PerCP、CD3 FITC、CD4 APC、CD8 PE、CD19 APC和自然杀伤细胞（NK）（CD16+CD56）PE。实验步骤按照制造商的说明进行。

形态分析

通过检查瑞氏-姬姆萨染色的骨髓涂片观察MDS髓系细胞的形态。首先，使用低倍镜（10倍物镜）的光学显微镜主观评估细胞的整体质量和分布。随后，在高倍镜（100倍油镜）下进行更详细的分析，以确定分化计数。

细胞遗传学分析

收集BM细胞，在添加20%新生牛血清的RPMI-1640培养基中培养24小时，采用国际人类细胞遗传学命名系统（ISCN2016）鉴定R带中期细胞及其相应的核型。12 至少20个中期分裂相分析为正常核型，至少10个中期分裂相分析为异常核型，核型根据IPSS-R分为5类（非常好、好、中等、差、非常差）。

统计分析

结果

患者特征

在我们的队列中， 表 1 和 2 描述研究人群的基线特征。数据是在 10 年内获得的，包括 94 名 MDS 患者，其中 54 名男性和 40 名女性，中位年龄为 59 岁（范围为 16-89 岁）。这些患者的中位 OS 为 14 个月（范围为 0-125 个月），11 名患者（11.7%）进展为 AML。 按照2016年WHO分类，所有患者分为：单系发育不良性MDS（MDS-SLD）11例（12%），多系发育不良性MDS（MDS-MLD）30例（32%），环状铁粒幼细胞MDS（MDS-RS）7例（7%），孤立性缺失（5q）MDS（MDS-5q-）0例（0%），1例过多母细胞1例（MDS-EB1）MDS18例（19%），22例（23%），MDS-EB2 22例，6例（6%）无法分类的MDS（MDS-U）。 按照2022年WHO分类，所有患者分类如下：SF3B1突变型MDS（MDS-SF3B1）6例（6%），TP53双等位基因失活型MDS（MDS-biTP53）0例（0%），纤维化型MDS（MDS-f）0例（0%），MDS-5q-型MDS 0例（0%），原始细胞减少型MDS（MDS-LB）8例（9%），原始细胞增多型MDS1（MDS-IB1）19例（20%），MDS-IB2型21例（22%），发育不全型MDS（MDS-h）40例（43%）。 此外，根据IPSS-R评分，90例患者被分为以下风险组：极低风险组7例（8%），低风险组22例（24%），中等风险组26例（29%），高风险组21例（23%），极高风险组14例（16%）。IPSS-R评分范围为1.0～10.0，中位数为4.0。 表格1 提供更多细节。几乎所有患者均接受了对症和支持治疗。72 例患者接受了进一步治疗，其中 35 例（37%）接受了强化化疗，11 例（12%）接受了造血干细胞移植（HSCT），16 例（17%）接受了去甲基化药物治疗。部分患者接受了不止一种治疗。

X-tile 算法根据 Log rank 检验确定了生存变化的适当阈值，从而得出了最低的 磷值为 7.9%。高 NK 组的 NK 百分比≥ 7.9%，而低 NK 组的 NK 百分比< 7.9%（图 1A）。在我们的队列中，CD4、CD8 和 CD19 对 MDS 中的 OS 没有影响，并且没有发现合适的截止值。未显示数据。

在我们的队列中，94 名 MDS 患者的 NK 百分比中位数低于 100 名健康捐赠者（13.6% vs 18.9%， 磷 = 0.007； 图 1B)。将 MDS 患者分为两组，以研究 NK 水平与其他临床和实验室特征之间的关系。结果显示，NK 水平较低的患者的 BM 原始细胞计数明显较高（磷 = 0.04)，IPSS-R 评分较高（磷 = 0.006)，且 PLT 较低（磷 = 0.005) 高于 NK 水平较高的患者。此外，NK 水平降低的患者在 IPSS-R 方面具有更高的风险分布 (磷 = 0.006）。两组间其他变量无显著差异（表格1）。

NK 细胞百分比下降与预后不良相关

在单变量分析中，OS 与男性性别呈负相关（磷 = 0.030)、血红蛋白较低 (<10 g/dl、 磷 = 0.029)、BM 原始细胞增多 (>5%、 磷 < 0.0001），高风险 IPSS-R 细胞遗传学（磷 = 0.032) 和较低的 NK 百分比 (磷 < 0.0001）。多变量分析的结果表明，NK 比例较低（<7.9%， 磷 = 0.012），男性（磷 = 0.016) 和更高的 BM 原始细胞 (磷 = 0.001) 与更差的 OS 相关。 表 2 展示了结果。

讨论

MDS是一组高度异质性的疾病，其发病机制涉及表观遗传改变、基因表达异常、造血微环境改变等多种因素。其中，免疫紊乱在MDS的发生发展中起着至关重要的作用。免疫紊乱可导致机体免疫监视功能下降，免疫稳态被破坏。T淋巴细胞通过免疫调节抑制造血干细胞，促进MDS的发生和发展。15 本研究结果显示，与健康人群相比，MDS患者外周血淋巴细胞亚群中NK细胞比例较低。本研究对94例初诊MDS患者进行统计学分析，进一步评估淋巴细胞亚群的临床价值。利用X-tile软件确定淋巴细胞亚群各指标的理想临界值，采用Kaplan-Meier法对结果进行比较。结果显示，由于造血功能受损，治疗前NK细胞比例较低与较高的BM原始细胞、较高的IPSS-R评分、较低的PLT相关。单因素分析显示NK细胞比例降低是MDS的不良预后因素，多因素分析显示NK细胞比例降低是影响MDS患者总生存期的独立危险因素。由于样本量有限，两组LFS差异无统计学意义，但NK细胞低下患者转化为AML的风险较高。

疾病进展是由免疫微环境引起的，免疫微环境在免疫逃逸和恶性克隆增殖中也发挥着动态作用。它还介导骨髓衰竭。16 免疫环境的变化（例如骨髓中炎症物质过多）会损害造血干细胞的功能，从而为克隆性造血和 MDS 的发生打开大门。免疫微环境的重要组成部分是免疫细胞。免疫系统对于 MDS 的发生和发展至关重要；这包括免疫逃逸、调节性 T 细胞减少、促凋亡细胞因子增加、B 细胞和 NK 细胞功能失调等。17 机体的免疫状态是通过T、B、NK淋巴细胞亚群的变化以及外周血淋巴细胞亚群的动态变化来反映的，可以反映全身的免疫状态。

研究证明了全身或局部免疫标志物对肿瘤患者的预后和预测价值，18 并且低外周血 CD4+/CD8+ 比率和 CD3+ T 细胞计数与肾细胞癌患者的总体生存率呈负相关。10 鼻咽癌治疗前外周血B淋巴细胞计数低的患者预后不良。19 有报道的研究表明，NK 细胞在头颈部鳞状细胞癌中具有良好的预后作用。20 此外，NK细胞比例较低的结肠癌患者的OS较NK细胞比例较高的患者短，NK细胞比例是独立的预后因素之一。21 在治疗体细胞之前，MDS 受到 NK 细胞介导的细胞毒性的影响，这表明 MDS 患者的 NK 细胞可能是治疗的目标。22 本研究结果显示NK细胞水平降低是MDS的独立危险因素，初诊MDS患者外周血淋巴细胞亚群中NK细胞水平低提示预后不良，总生存期短，而其他淋巴细胞亚群指标对预后的影响无统计学意义。本研究存在一定的局限性，首先，本研究为回顾性研究，容易产生选择偏倚和混杂因素，另外本研究未检测患者淋巴细胞亚群的绝对数量，不能准确反映机体的免疫状态。其次，收集到的数据中发展为白血病的病例极少，难以评估淋巴细胞亚群水平与MDS发展为白血病的可能性之间的相关性。若要支持进一步的研究，必须收集更多的样本。最后，整体结论受到研究设计、样本量和方法学局限性的明显限制，多中心和更大规模的队列复制将有益于结论的准确性。

结论

外周血作为肿瘤微环境中免疫细胞的主要来源，具有采集速度快、处理简便、可动态监测等优点。MDS患者免疫细胞改变与客观临床反应之间的关系将成为临床研究的重点，有助于了解免疫系统各组成部分及其在MDS预后中的作用。本研究分析了MDS患者外周血淋巴细胞亚群比例与疾病预后的关系，为进一步研究肿瘤预测和治疗有效的预后免疫学指标提供数据。