蚊子
用于实验的蚊子幼虫以上述方式饲养。 将实验用蛹转移至装有60ml水的塑料圆筒（直径16×16.5cm，直径×高）中，并用网筛密封。 成蚊在羽化后的前48小时内提供与5%多种维生素糖浆溶液混合的5%糖溶液，然后随意提供10%蔗糖溶液直至实验。 实验用蚊子在羽化后 5-7 天吸血时老化。 通过抽吸将蚊子轻轻转移到顶部用网筛密封的0.5升圆柱形纸板容器中，每个容器容纳40只蚊子。 将蚊子饲养在直立培养箱中，培养箱温度保持在 25 ± 1 °C，相对湿度为 80 ± 10%，光照/黑暗周期为 12/12 小时。 蚊子缺乏糖分，但在吸血前 16 至 20 小时可以喝水。
化合物
外消旋伊维菌素购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。 粉末状伊维菌素 B1a（纯度 95.0%）获自 Toronto Research Chemicals（加拿大安大略省多伦多）。 粉末状伊维菌素 B1b（纯度为 99.27%）获自 ClearSynth Labs（印度孟买）。 伊维菌素 6 mg 片剂 (Vermectin®) 购自 Atlantic Laboratories Corp., LTD（泰国曼谷）。
蚊血粉制备
所有化合物均溶解在二甲基亚砜 (DMSO) 中，浓度为 2 mg/ml，并将溶液冷冻于 − 20 °C 直至进行蚊子进食实验。 在每次蚊膜喂养当天，将健康志愿者的全血收集到肝素钠管中。 将冷冻的化合物储备溶液解冻，并使用玻璃琥珀小瓶在人 AB + 血浆中进行系列稀释。 将最终血浆储备溶液（10 μl）与空白全血（990 μl）混合，以达到蚊膜喂养测定所需的最终浓度。 对于 An 的实验。 向蚊子喂食浓度范围为 2 至 30 nM 的 Dirus、伊维菌素化合物； 为。 最小，浓度范围为 0.25 至 4 nM。 所有为蚊子喂食而准备的血液样本均含有 < 1% 的有机溶剂。 制备对照血粉； 这些药物由不含伊维菌素化合物的冷冻 DMSO 组成，在血浆中稀释，以匹配含化合物血粉中 DMSO 与血液的最高比例。
蚊膜喂养和死亡率测定
在每次蚊膜喂养时，将与不同浓度的不同化合物混合的全血提供给每组 40 只。 迪鲁斯和 40 An。 最小蚊子通过膜饲养器加热至 37°C。 允许蚊子进食膜长达 30 分钟。 膜喂养后，通过抽吸将每个容器最多 30 只吸血蚊子轻轻转移到干净的纸板容器（0.5 升）中，并将容器置于培养箱中，温度为 25 ± 1 °C，湿度为 80 ± 10%，湿度为 12/12 -h 光/暗光周期。 向蚊子随意提供10%蔗糖。 吸血后 10 天，每天监测蚊子的存活情况，并通过抽吸除去所有死亡的蚊子并记录。 吸血十天后，所有剩余的蚊子都被记录为活的，然后冷冻起来。
伊维菌素 B1a 和 B1b 的液相色谱-质谱法测量
将外消旋伊维菌素溶解于 50:50 甲醇:水至终浓度为 1 mg/ml，然后用 40:60 乙腈:水稀释 10,000 倍。 将 5 µl 稀释伊维菌素溶液样品 (100 ng/ml) 注入液相色谱-质谱 (LC-MS) 系统。 将伊维菌素片剂在研钵中粉碎，并将1mg粉末溶解在50:50甲醇:水中至终浓度1mg/ml。 将压碎的片剂混合物用 40:60 乙腈:水稀释 10,000 倍，并超声处理 30 分钟。 将 5 µl 稀释伊维菌素样品 (100 ng/ml) 注入 LC-MS 系统。 测量片剂和外消旋伊维菌素粉末中的伊维菌素 B1a 和 B1b，以获得 B1a 与 B1b 的比率。
使用的 LC-MS 系统是与四极杆耦合的高效液相色谱 (HPLC) 系统（Agilent 1260 四元泵、Agilent 1260 高性能自动进样器和 Agilent 1290 恒温柱温箱 SL；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）飞行时间质谱仪 (Q-TOF-MS)（TripleTOF 5600+；Sciex, Framingham, MA, USA），使用 DuoSpray 离子源进行电喷雾电离 (ESI)。 HPLC 流动相为含有 10 mM 乙酸铵和 0.1% 甲酸的水（流动相 A），以及含有 10 mM 乙酸铵和 0.1% 甲酸的乙腈:水（体积比为 95:5）（流动相 B ）。 分析过程中，LC 瓶在 6 °C 下保存在自动进样器中。 将样品混合物注射到受预柱保护的 C18 反相柱（Acquity UPLC HSS T3，2.1 × 100 mm，1.8 μm；Waters Corp.，Milford，MA，USA）上（Acquity UPLC HSS T3，2.1 × 5 mm， 1.8 μm；Waters Corp.），在 40 °C 下以 0.3 ml/min 的流速分离。 HPLC 洗脱梯度从 40% 流动相 B 开始 2.0 分钟（0–2.0 分钟），然后是 40–80% B 2.0 分钟（2.0–4.0 分钟），80–100% B 5.0 分钟（4.0–9.0 分钟）。分钟），100% B 5.0 分钟（9.0–14.0 分钟），100–40% B 0.1 分钟（14.0–14.1），40% B 3.9 分钟（14.1–18.0 分钟）。 HPLC-Q-TOF-MS系统、质量离子色谱图和质谱图通过Analyst™软件1.7版(Sciex)获得。 Q-TOF-MS 在 ESI 正模式下运行，离子源气体 1 和 2 各为 40 psi，帘气为 30 psi，离子喷雾电压为 4500 V，源温度为 350 °C，去簇电位为 120 V. 数据以信息相关采集模式采集，由 TOF-MS 扫描和高灵敏度模式下的 10 个相关子离子扫描组成，并具有动态背景扣除。 TOF-MS 扫描的质量范围为 m/z 100–1000，产物离子扫描的质量范围为 m/z 50–1000。 伊维菌素 B1a 和 B1b 水平的定量通过 MultiQuant™ 软件 (Sciex) 采用高分辨率 TOF-MS 扫描模式进行。
统计分析
使用归一化四变量浓度响应分析（IC50）估算杀死 50% 和 90% 蚊子的致死浓度（分别为 LC50 和 LC90） [half-maximal inhibitory concentration]， 爬坡道 [Hill-Slope]艾敏 [point of minimum mortality]，和EMAX [point of maximum mortality]）。 所有参数均根据观测数据估算，但 EMAX 除外，假设 EMAX 在无限浓度下达到 100%。 点估计周围的 95% 置信区间 (95% CI) 是使用对称（渐近）近似得出的。 所有蚊子存活分析均使用 GraphPad Prism v.10.2（GraphPad Software Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）进行。
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2024-05-15 19:54:42
