研究区
该研究在刚果共和国戈马采采卫生区的 Ntoula 和 Djoumouna 村进行 [20]。 该地区属湿润热带气候，季节分明：干燥（六月至九月和一月至二月）和雨季（十月至一月和三月至五月）。 年降雨量为1600至2000毫米。 平均气温 20–32 °C，湿度在 78% 到 84% 之间 [20]。 朱穆纳 (Djoumouna) 距离布拉柴维尔 25 公里，周围有四条河流（Lomba、Kinkoue、Loumbangala 和 Djoumouna），这些河流流入鱼塘，成为潜在的疟疾媒介地点 [4]。 恩图拉位于布拉柴维尔东南30公里处，有多条河流（刚果、恩图拉、卢穆），促进按蚊幼虫的发育 [19]。 两个村庄居民的主要职业是农业和渔业。
蚊虫采集及处理
该研究是在旱季进行的。 2022 年 6 月至 9 月连续四个月进行灭蚊工作。每周 5:00 至 10:00 使用电动吸引器（Rule In-Line Blowers，型号 240，中国）在室内收集 8-10 户房屋的蚊子。 该研究共包括 90 个至少采集到 1 个按蚊的房屋（朱穆纳 52 个房屋和恩图拉 38 个房屋）。 采集后，将蚊子保存在小纸杯中，运至实验室。
记录的信息包括收集的蚊子数量、房屋类型、墙壁类型、每间房屋的房间数、家中居住人数、睡在蚊帐下的人数、收集日期和时间以及动物数量收集表（调查问卷）。 收集后，将按蚊与按蚊分离，并从形态学上鉴定按蚊种类 [21]。 根据腹部的生理状态（未进食、吸血、半妊娠、妊娠）记录每只雌性按蚊。 对 An 进行卵巢解剖。 冈比亚 sl 雌性空腹（未进食），如 Champ 等人先前所述。 [22]。 然后将蚊子单独储存在带有干燥剂的标记良好的试管中，并保存在-20°C的冰箱中以供后续分析。
按蚊物种的分子鉴定
使用 Livak 提取方法从 144 只雌性蚊子（冈比亚按蚊复合体）中提取完整的蚊子 DNA [23]。 提取的 DNA 样本进行聚合酶链反应 (PCR) 分析 [24] 使用针对 An 逆转录转座子的 SINE200 引物。 gambiae sl 种，从而使我们能够区分 An. coluzzii 来自 An. 冈比亚 ss 和 An. 阿拉伯树 [24]。 PCR 混合在 14 µl 反应体积的主混合物中进行（1.5 µl PCR 缓冲液 10×、0.75 µl 25 mM MgCl2、0.12 µl 10 mM dNTP、0.51 µl 10 µM SINE_Foward 和 0.51 µl 10 µM SINE_Reverse引物、0.12 µl KAPA Taq DNA 聚合酶 5U/µl 和 10.49 µl 无核酸酶水）。 将 1 μl 基因组 DNA 添加到预混液中作为模板，并在热循环仪（Mastercycler X50a，Eppendorf AG，Hamburg，Germany）中进行扩增，使用 95 °C 初始变性 5 分钟，然后95℃变性30秒，54℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，最后延伸72℃10分钟，10℃保温，共35个循环。 靶向 An 的 SINE200 反转录转座子的引物的详细信息。 冈比亚 sl 出现在附加文件中 1：表S1。 PCR 产物和 100 碱基对 (bp) 分子量标记用 SYBR Green 溶液（1:1，v/v）染色，在 1.5% 琼脂糖凝胶中 100 V 电泳 50 分钟，并在 GelDoc™ 上可视化EZ 成像仪（Bio-Rad 实验室，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国）。 样本被认为对 An 呈阳性。 冈比亚，An. coluzzii 或 An. 如果分别检测到 249 bp、479 bp 或 223 bp 条带，则为 arabiensis。
疟原虫属的检测在安。 冈比亚有限公司
TaqMan 检测用于检测某些按蚊物种雌性中的疟原虫种类。 gambiae sl 这种非常灵敏的方法能够检测恶性疟原虫，但无法区分三日疟原虫与卵形疟原虫和间日疟原虫。 简而言之，扩增在 10 µl 反应体积中进行，其中包括 1 µl 基质 DNA、5 µl (1 µM) SensiMix II Probe (1.25 ml)、0.8 µl (10 mM) PlasF（正向引物）、0.8 µl (10 mM) PlasR（反向引物）、0.3 µl Falcip+、0.2 µl OVM+ 和 1.9 µl 无核酸酶水。 使用以下条件在 LightCycler 480 实时 PCR 系统（Roche，SN：20726）中扩增样品：在 95 °C 预变性 10 分钟，然后在 92 °C 15 秒 1 分钟进行 40 个循环在60°C。 引物（Falcip+ 和 Plas-F）与带有荧光团标记的两个探针（FAM 用于检测恶性疟原虫，HEX 用于检测卵形疟原虫、三日疟原虫和间日疟原虫）一起使用。 使用两个恶性疟原虫样本以及卵形疟原虫、间日疟原虫和三日疟原虫的混合物作为阳性对照。 针对疟原虫属 18S 核糖体 RNA (rRNA) 基因的引物详细信息。 和探针在附加文件中提供 1：表S1。 对 TaqMan 阳性样本进行巢式 PCR 确认并区分三日疟原虫与卵形疟原虫和间日疟原虫 [25]。
第一轮巢式 PCR 反应包括选择性扩增疟原虫属 DNA。 第一轮 PCR 在 20 μl 反应体积中进行，其中包含 PCR 缓冲液 10×、10 nM dNTP、25 mM MgCl2、5U/μl DreamTaq DNA 聚合酶、蒸馏水、10 µM rPLU5 正向引物和 10 µM rPLU6 反向引物和 2 µl 基因组 DNA。 扩增在热循环仪（Mastercycler X50a，Eppendorf AG，汉堡，德国）中进行，首先在 94 °C 下变性 4 分钟，然后在 94 °C 下变性 30 秒，在 55 °C 下退火 35 个循环1 分钟，72°C 延伸 1 分钟，最后 72°C 延伸 4 分钟。 第二轮 PCR 反应旨在使用第一轮 PCR 反应的产物作为模板和设计用于扩增恶性疟原虫 (rFAL1/rFL2)、卵形疟原虫的特定序列的引物来进行疟疾寄生虫的物种形成。 (rOVA1/rOVA2)、三日疟 (rMAL1/rMAL2) 和间日疟 (rVAV1/rVAV2)，如附加文件中所示 1：表S1。 对于第二轮 PCR 反应，将 1 μl 第一轮 PCR 的产物添加到 19 μl 如上所述制备的主混合物中，并使用热循环仪在与第一轮 PCR 相同的循环条件下进行扩增反应，不同之处在于退火温度为58℃。 附加文件中提供了所用引物的详细信息 1：表S1。
PCR 产物和 100 bp 分子量标记物用 SYBR Green 溶液（1:1，v/v）染色，在 1.5% 琼脂糖凝胶中以 100 V 电泳 45 分钟，并在 GelDoc™ EZ 成像仪（Bio- Rad 实验室，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国）。 如果检测到 205 bp、144 bp、800 bp 或 120 bp 条带，则认为样品对恶性疟原虫、疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫呈阳性。 我们库中已知的疟原虫阳性样品和蒸馏水在每组反应中充当阳性和阴性对照。
数据分析
所有统计测试均使用 GraphPad Prism 6.01 软件进行。 分类变量以比例表示。 Fisher 精确检验用于比较 An 物种的比例。 冈比亚复合体及其对 Ntoula 村与 Djoumouna 村疟原虫物种传播的贡献。 卡方检验用于比较朱穆纳和恩图拉的蚊子物种丰度，或比较两种环境之间的蚊子奇偶率。 显着性阈值设置为 P < 0.05。
本研究纳入的疟疾传播昆虫学指标为人咬率、感染率、昆虫学接种率（EIR）、胎次率和静息按蚊密度。
咬人率（ma），也称为攻击性密度，是与人类接触的按蚊密度（m）和嗜人率（a）的乘积。 它的计算方法是，将某个物种捕获的饱胀雌性的总数 (F) 除以在捕获发生的房间里过夜的总人数 (W)。 人咬率以每人每晚被按蚊叮咬的次数表示。
$${varvec{m}}{varvec{a}}={varvec{F}}div {varvec{W}}$$
疟原虫感染率是指被感染或唾液腺中携带子孢子的蚊子的比例。 该指数以百分比表示（被检查的蚊子数量中受感染的蚊子数量×100）。
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EIR 是在给定时期内被按蚊叮咬的传染性数量。 它以每人每晚/日/周/月或年的传染性叮咬次数表示。 ({varvec{E}}{varvec{I}}{varvec{R}}=left[mathbf{M}mathbf{a}mathbf{n}-mathbf{b}mathbf{i}mathbf{t}mathbf{i}mathbf{n}mathbf{g},mathbf{r}mathbf{a}mathbf{t}mathbf{e},left(mathbf{m}mathbf{a}right)right]mathbf{x}左[mathbf{s}mathbf{p}mathbf{o}mathbf{r}mathbf{o}mathbf{z}mathbf{o}mathbf{i}mathbf{t}mathbf{e},mathbf{r}mathbf{a}mathbf{t}mathbf{e}left(mathbf{s}right)right]={varvec{m}}{varvec{a}}boldsymbol{ }mathbf{x}{varvec{s}})
静息按蚊密度 (D) 是指家庭内静息蚊子的数量除以调查的房屋数量和捕捉的夜晚数。 它以每间房屋每晚的雌性蚊子数量表示。
$${varvec{D}}=(frac{{varvec{n}}{varvec{u}}{varvec{m}}{varvec{b}}{varvec{e}}{ varvec{r}},boldsymbol{ }{varvec{o}}{varvec{f}},boldsymbol{ }{varvec{f}}{varvec{e}}{varvec{ m}}{varvec{a}}{varvec{l}}{varvec{e}}{varvec{s}}}{{varvec{n}}{varvec{u}}{varvec {m}}{varvec{b}}{varvec{e}}{varvec{r}},boldsymbol{ }{varvec{o}}{varvec{f}},boldsymbol{ }{varvec{h}}{varvec{o}}{varvec{u}}{varvec{s}}{varvec{e}},boldsymbol{ }{varvec{p}}{ varvec{r}}{varvec{o}}{varvec{t}}{varvec{e}}{varvec{c}}{varvec{t}}{varvec{e}}{ varvec{d}}boldsymbol{ }})/{varvec{N}}{varvec{u}}{varvec{m}}{varvec{b}}{varvec{e}}{varvec {r}},boldsymbol{ }{varvec{o}}{varvec{f}},boldsymbol{ }{varvec{n}}{varvec{i}}{varvec{g} }{varvec{h}}{varvec{t}}{varvec{s}}$$
胎次率 (P) 是指经产雌性（至少产卵一次的雌性）的比例除以按蚊总数（解剖）。 年长的蚊子种群将表现出更高的胎次率。 老年人更有可能传播疟疾，因为他们的寿命足以让寄生虫生长。
$${varvec{P}}=frac{{varvec{n}}{varvec{u}}{varvec{m}}{varvec{b}}{varvec{e}}{ varvec{r}},boldsymbol{ }{varvec{o}}{varvec{f}},boldsymbol{ }{varvec{p}}{varvec{a}}{varvec{r }}{varvec{o}}{varvec{u}}{varvec{s}},boldsymbol{ }{varvec{A}}{varvec{n}}{varvec{o}} {varvec{p}}{varvec{h}}{{varvec{e}}{varvec{l}}{varvec{e}}{varvec{s}}}{{varvec{T } }{varvec{o}}{varvec{t}}{varvec{a}}{varvec{l}},boldsymbol{ }{varvec{n}}{varvec{u}} { varvec{m}}{varvec{b}}{varvec{e}}{varvec{r}},boldsymbol{ }{varvec{o}}{varvec{f}}, 粗体符号{ }{varvec{A}}{varvec{n}}{varvec{o}}{varvec{p}}{varvec{h}}{varvec{e}}{varvec{ l }}{varvec{e}}{varvec{s}},boldsymbol{ }{varvec{d}}{varvec{i}}{varvec{s}}{varvec{s} } {varvec{e}}{varvec{c}}{varvec{t}}{varvec{e}}{varvec{d}}}mathbf{X}100$$
多样性指数
为了评估 An. 的多样性，还确定了 Shannon-Weaver (H′) 和 Simpson (D) 多样性指数。 每个调查地点内都有冈比亚综合体。 这些指数考虑按蚊物种的数量或这些物种内个体的分布 [26]。
香农-韦弗指数 (H) 是在信息论框架内开发的，该框架假设物种的多样性可以通过代码或消息中包含的信息来衡量 [27] 确定给定环境中物种的多样性。 香农指数没有单位，按以下公式计算：
$$H=-sumnolimits_{n=1}^{s}{{text{log}}}_{2}ni/N$$
其中 H 是香农-韦弗指数，N 是总数，ni 是采样区域中物种的频率，S 是采样区域中存在的物种总数。
该指数在 0 到 5 之间变化； 接近 0 的值表示多样性非常低。
辛普森指数 (D) 衡量两个随机选择的个体不属于同一物种的概率。 它与多样性成反比。 该公式通过从辛普森指数的最大值中减去辛普森指数来建立直接代表异质性的指数，即1 [26]。 对于无限样本，该指数由以下公式给出：
$${mathbf{D}}, = ,frac{{sum {{text{n}},left( {{text{n}}, – ,1} right )}}{{{text{N}},left( {{text{N}}, – ,1} right)}}$$
其中 D 是辛普森指数，n 是物种的个体数，N 是捕获的物种总数。 该指数在0和1之间变化； 值为 1 表示在样本中遇到相同物种的可能性为 100%。
2024-03-02 08:57:58
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