新型 MAXPOWER 生物抗菌液可根除口腔幽门螺杆菌 | BMC 传染病

材料

乳酸甲氧苄啶（T9170）、万古霉素（V8050）、两性霉素B（A8251）、硫酸多粘菌素B（P8350）均购自Sigma-Aldrich公司（上海）；细胞计数试剂盒-8（CK04）、尿素酶活性测定试剂盒（编号BC4110）、活/死细胞染色试剂盒（编号40747ES76）均购自上海雅森生物技术有限公司（上海）；尿素检测试剂盒购自山东博安生物科技有限公司（南京）；SYTO 9/PI活/死细菌双染试剂盒（编号MX4234-40T）购自上海牟康生物技术有限公司（上海）。 二辛可宁酸(BCA)蛋白测定试剂盒(编号23,227)购自Thermo Fisher Scientific Inc.(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)。H. pylori菌株由南昌大学第一附属医院(中国江西)消化内科提供。

细胞培养和幽门螺杆菌菌株

小鼠成纤维细胞（L929）购自中国科学院细胞库（北京），在含有10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（w/v）青霉素/链霉素的杜氏改良Eagle培养基（DMEM）/F12（Gibco，纽约州大岛，美国）中培养，培养箱为37°C、5% CO2 气氛。本研究中使用的H. pylori菌株CagA+ATCC43504由南昌大学第一附属医院谢川教授提供。所有H. pylori菌株均保存在-80°C下。使用前，将它们在含有5%（v/v）羊血和1%（w/v）混合抗生素的血琼脂平板上在37°C、10% CO2和5% O2气氛下复苏并培养两代。 H. pylori液体培养体系包括布鲁氏菌肉汤、10% (v/v) FBS和0.5% (w/v)混合抗生素，培养物在微量振荡器上孵育。

老鼠

所有动物实验均按照海军军医大学长海医院实验动物中心（上海，中国）批准的方案（SYXK2020-0033）进行，并根据 ARRIVE 指南进行报告。昆明小鼠购自上海实验动物中心（上海，中国），并在上海长海医院胰腺疾病研究所（上海，中国）的特定无病原体 (SPF) 条件下饲养。它们被饲养在相对湿度约为 55% 和温度为 18–22 °C 的环境中，光照/黑暗循环为 12 小时。

体外细胞相容性

采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和活/死细胞染色法评估体外细胞相容性。将L929细胞以104/孔的密度接种于96孔板中。让细胞贴壁过夜，向培养基中添加不同浓度的MAXPOWER生物抗菌溶液（原液、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16）以探索对细胞安全的最佳浓度。然后将细胞孵育24小时，每个培养基用100 µL/孔10％（w/v）CCK-8染料溶液替换。然后再继续孵育2小时。通过在微量读数仪（SpectraMax®i3；Molecular Devices LLC，美国加利福尼亚州圣何塞）中测量每个孔在450nm处的吸光度（OD450）来计算细胞活力。 每组有三个重复孔，细胞活力按以下公式（1）计算：

活/死细胞染色试验是将 MAXPOWER 生物抗菌液与 L929 细胞共培养，然后在 37°C 下用钙黄绿素 AM 和碘化丙啶 (PI) 染料替换培养基 30 分钟。然后在倒置相差显微镜 (DMIL LED，徕卡显微系统，德国韦茨拉尔) 下观察细胞。

溶血评估

采集大鼠新鲜血液，5000 rpm 离心 3 min，用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤 3 次。取 2 mL 血液用生理盐水稀释至 50 mL，取 300 µL 稀释血液与 1.2 mL 含有不同浓度 MAXPOWER 生物抗菌液（原液、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16）的生理盐水混合。取 300 µL 红细胞分别与 1.2 mL 生理盐水和 1.2 mL 去离子水混合，作为阴性对照和阳性对照。37 ℃ 孵育 2 h，用酶标仪在 540 nm 处测量上清液吸光度（OD540）。溶血率计算如下式（2）：

针对幽门螺杆菌的抗菌试验

将H. pylori从布氏菌肉汤中收获，调整其密度为106 CFU/mL。将H. pylori悬浮液和2 mL MAXPOWER生物抗菌液加入到由5 mL布氏菌肉汤、500 μL FBS和25 μL混合抗生素（40 mg 强力霉素、60 mg 甲硝唑、40 mg 两性霉素B、50 mg万古霉素溶于200 ml无菌蒸馏水）组成的液体培养体系中，在10% CO2和5% O2的环境下，37 ℃、150 rpm 振荡培养0.5 min、1 min、1.5 min。将悬浮液稀释200倍后，涂布于哥伦比亚琼脂平板上，培养3～4天后计数。 还测量了悬浮液在 600 nm (OD600) 处的吸光度。

活/死荧光染色

将布鲁氏菌培养液中收获H. pylori，调整其密度为106 CFU/mL，取1 mL H. pylori与2 mL MAXPOWER生物抗菌液（浓度为原液的25%）共培养不同时间（0.5 min、1 min、1.5 min），加入SYTO 9/PI活/死菌双染试剂，弱光孵育15 min，在荧光显微镜（编号MF43-N；广州微射科技（MSHOT）公司）下拍照。

抗菌机制研究

将幽门螺杆菌分散于布氏杆菌培养液中，分别与PBS（对照组）或MAXPOWER生物抗菌液（浓度为原液的25%）孵育0.5 min、1 min、1.5 min，5 000 rpm 离心10 min，去上清。（i）扫描电镜（SEM）对幽门螺杆菌进行形态学检查，取上清菌用2.5%（v/v）戊二醛固定，4 ℃ 孵育过夜，3 000 rpm 离心10 min，以50%（v/v）、70%（v/v）、90%（v/v）、100%（v/v）乙醇梯度脱水，每步10 min。 样品经冻干、溅射镀金处理，在扫描电镜下观察H. pylori形态，每组随机选取6个视野，计数该视野内破碎细菌占总细菌数的百分比。ii)H. pylori蛋白漏出。吸出上述悬液后，使用BCA试剂盒按照说明书操作，测定漏出的蛋白浓度，用分光光度计在562nm处检测。iii)H. pylori尿素酶活性。用尿素酶试剂盒和尿素酶检测液(0.9%(w/v)NaCl，20mM尿素，14µg/mL酚红)测定H. pylori在MAXPOWER生物抑菌液(浓度为原液的25%)作用不同时间(0.5min，1min，1.5min)后的尿素酶活性，用分光光度计测OD550。

肠道菌群分析及动物体内组织安全性评估

将无特定病原体（SPF）雄性昆明小鼠（6～7周龄，体重20～25 g）分为对照组和实验组（n=6/组）。实验组每天早晨灌胃MAXPOWER生物抗菌液（浓度为原液的25%）200 µL/只/d，隔日灌胃，共灌胃4次。对照组灌胃200 µL 0.9%生理盐水。小鼠自由采食，定期称重。最后一次治疗后的第二天早晨，将小鼠放在干净、无菌的容器中收集新鲜粪便样本，通过上海岱宣生物技术有限公司（上海，中国）进行的16S rRNA测序确定其中的细菌数量和多样性。灌胃后第28天对小鼠实施安乐死，收集其血清进行生化和血常规检测。 切除心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，解剖并用苏木精-伊红（HE）染色，以评估MAXPOWER生物抗菌液的安全性。

转录组分析

将幽门螺杆菌（OD600=1）与PBS共孵育2min，再与MAXPOWER生物抗菌液（浓度为原液的25%）共孵育2min，离心收集后进行高通量测序。实验采用TruSeq™ Stranded Total RNA Library Prep Kit（Illumina，20,020,594）进行文库构建。简要地说，去除rRNA后，加入片段化缓冲液获得mRNA片段。随后逆转录合成cDNA，使用End Repair Mix连接接头。PCR扩增前，用UNG酶消化第二条cDNA链，确保文库只包含第一条cDNA链。最后在NovaSeqXPlus平台和DNBSEQ-T7平台上进行测序。使用Majorbio云平台（上海梅杰生物医学科技有限公司，中国）对生物信息学数据进行分析。

临床研究设计

研究开始时，详细记录所有参与者的人口统计学特征，包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、口臭和胃肠道症状。使用 SPSS v. 25.0（IBM Corp.，美国纽约州阿蒙克市）将患者随机分配接受 Novel MAXPOWER 生物抗菌液（浓度为原始溶液的 25%）或水。随机化比例为 1:1。要求所有患者在早上和睡前照常刷牙一次，连续 7 天。此外，要求他们用 Novel MAXPOWER 生物抗菌液漱口 3 次/天，每次 2 分钟。第 8 天早上醒来后，立即进行口腔 H. pylori 唾液抗原 (HPS) 测试以检测口腔 H. pylori [17]。

研究的主要结果是基于意向治疗 (ITT) 和按方案 (PP) 分析的口服幽门螺杆菌根除率。

统计分析

所有数据均以平均值±标准差（SD）表示，并使用 SPSS v. 25.0 和 GraphPad Prism v. 9.5（GraphPad Software，美国加利福尼亚州拉霍亚）进行分析。p < 0.05 被认为具有统计学意义。