病人材料
本研究纳入2017年7月至2018年7月上海闸北中心医院收治的90例HPV 16感染（我国最常见的hr-HPV）患者和30例单纯慢性CT感染患者。 根据上海闸北中心医院机构审查委员会批准的方案，所有个人均获得了血液和组织采样的书面知情同意书。
90例HPV 16感染患者中，CT/HPV合并感染组37例，HPV感染组53例。 30 名 CT 感染患者和 30 名健康捐赠者（对照组）也参与了该研究。 患者特征总结于表中 1。 各组一般资料差异无统计学意义（P>0.05）。 收集血液样本、脱落的宫颈细胞和宫颈上皮活检样本（2-5 mm2）。 通过宫颈拭子收集脱落细胞。 使用 INNO-LiPA HPV 基因分型额外试剂盒（Innogenics，Seguin，TX）进行 HPV 基因分型。 使用ABON沙眼衣原体抗原检测试剂盒（中国福建）进行CT筛查，并通过衣原体TaqMan PCR试剂盒（加拿大Norgen Biotek）确认结果。细胞学结果按照2014 Bethesda系统分类为（a）阴性对于上皮内病变或恶性（NILM），（b）意义未明的非典型鳞状上皮细胞（ASCUS），（c）低度鳞状上皮内病变（LSIL），（d）非典型鳞状上皮细胞和高度鳞状上皮内病变不能被排除（ASC-H），（e）高度鳞状上皮内病变（HSIL），或（f）鳞状细胞癌（SCC） [23]。
表 1 患者人口统计和疾病特征
朗格汉斯细胞生成和共刺激分子分析
如前所述，将 LC 从不同组患者的 PBMC 中分离出来 [24]。 简而言之，将 PBMC 在补充有 1000 U/ml GM-CSF、2 mM L-谷氨酰胺、10 mg 链霉素、10% 胎牛血清 (FBS)、1000 U/ml IL-4 和 10 μg/的 RPMI 培养基中孵育。 ml TGF-β 7 天。 通过流式细胞术确认LC表型（CD1a+Langerin+CD14-）。
通过流式细胞术分析表面标记表达。 简言之，收获、洗涤 106 个 LC，并用抗 MHC I (ab134189，Abcam)、MHC II (ab55152，Abcam)、CD80 (ab134120，Abcam)、CD83 (ab275021，Abcam)、CD86 (ab239075，Abcam) 的抗体染色。和 CD40 (ab224639, Abcam Inc., Cambridge, UK) 或与同种型对照一起孵育 1 小时，并用 FACS 缓冲液洗涤。 所有流式细胞分析均使用 FC500 流式细胞仪进行。 然后，我们用 20 μM LY294002 (EMD Biosciences)（一种有效的 PI3K 特异性抑制剂）处理 LC，并再次分析表面标记物表达。 流式细胞术数据被量化为中值荧光强度（MFI）并使用 FlowJo 软件（FlowJo，LLC）进行分析。
免疫荧光染色
测量宫颈活检样本中朗格汉斯细胞 (LC) 和 Treg 浸润的密度。 LC 是持续表达 CD11c 的 Langerin (CD207) 阳性树突状细胞 [25]。 将宫颈活检样本切成厚度为 5 µm 的冰冻切片，并用抗 CD207Ab（ab283686，Abcam）染色，然后用 TRITC 缀合的二抗染色。 然后，将细胞与抗 CD11c 抗体（ab52632，Abcam Inc.，剑桥，英国）一起孵育，然后与 FITC 偶联的二抗一起孵育。 为了检测 Tregs，宫颈活检样本先用抗 FOXP3 抗体（ab215206，Abcam）染色，然后用 FITC 偶联的二抗染色。
通过共焦荧光显微镜对样品进行成像，并使用 ImageJ 软件（美国贝塞斯达国家心理健康研究所）对尺寸大于 4.5 µm 的可见荧光物体的细胞进行定量 [26]。
蛋白质印迹分析
如上所述收集来自不同组的LC，用PBS洗涤两次。 使用哺乳动物蛋白提取试剂（Pierce）制备细胞提取物。 使用一抗top-ERK1/2(CST,4694S, cell signalling Technology Co.LTD. Massachusett, USA)、ERK1/2(CST,4695S)、p-MAPK激酶(MKK)4(CST,9151S)进行免疫印迹、MKK4(CST,9152S)、PI3K(ab278545)、p-PI3K (ab278545,ABCAM Inc.,Cambridge,Uk)、AKT(CST,9272S) 和 p-AKT(CST,13038S) 或 GAPDH(CST,5174 T) ，细胞信号技术有限公司，马萨诸塞州，美国）。
如先前报道，GAPDH 用作内部对照 [27]。 还使用了 HRP 缀合的抗兔或抗小鼠二抗。 使用增强化学发光蛋白质印迹检测试剂对蛋白质进行可视化，并使用 HMIAS-2000 成像系统进行检测。 带密度由 Bio-Rad Quantity One 软件测定并量化为与 GAPDH 的比率。
抗原呈递能力分析
使用混合淋巴细胞反应测定（MLR）进行抗原呈递能力分析 [28]。 将宫颈上皮活检样本（2-5 mm2）与 Dispase II（2.4 U/ml）一起孵育 45 分钟，然后用 0.03% 胰蛋白酶和 0.02% DNase 消化； 从每个样品中获得大约 (0.05–0.2) × 106 上皮细胞。 上皮细胞（包括 500-1000 个 LC）被用作刺激器，来自对照组的相同数量的 PBMC 被用作响应器。 将细胞混合并在 RPMI 1640 中孵育 3 天。 [3H]-TdR（0.5 μCi/孔）在最后 18 小时的孵育中添加。 收获细胞并掺入 [3H]使用 Top Count 微孔板闪烁和发光计数器（Packard Instrument，Meriden，CO）测量 DNA 中的 TdR。 结果表示为增殖指数（平均放射性cpm（平均每分钟计数）/平均cpm）。
流式细胞术
使用流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞亚群以及T淋巴细胞凋亡。 使用Ficoll密度梯度离心分离PBMC。 将来自每位患者或健康供体的总共 5 × 106 个细胞/ml 分别悬浮在 PBS 中，并使用以下单克隆抗体在 4°C 下染色 1 小时：CD4-PEcy7（ab233660，Abcam Inc.）、CD8-APC- Cy7（ab233300，Abcam Inc.）和 CD3-FITC（ab34275，Abcam Inc.，剑桥，英国）。 然后，将细胞重悬于冷 PBS 中。 所有样品均使用 BD FACS Canto II 流式细胞术系统（BD Biosciences）进行分析。
使用 PE-Annexin V 染色（BD Biosciences）评估 T 淋巴细胞的凋亡。 使用 FlowJo 软件分析数据。
统计数据
采用SPSS 20.0统计软件对统计数据进行处理。 不同测定（共刺激分子测定、LC 密度分析、MLR 测定和流式细胞术）的统计显着性通过单向方差分析确定整体显着性，然后进行 Tukey 多重比较检验。 进行非参数曼-惠特尼 U 检验来分析在三个重复孔中进行的来自单个供体的技术重复的代表性实验。 P < 0.05 被认为表明存在显着差异。
2024-02-20 13:33:55
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