高危成人门诊患者莫努匹拉韦 SARS-CoV-2 病毒和抗体反应的随机对照试验

样品采集

为了有资格参加 PANORAMIC 研究 (ISRCTN30448031)，参与者必须在过去 5 天内出现症状，在过去 7 天内确诊过 COVID-19 感染（PCR 或快速抗原 SARS-CoV-2 检测呈阳性） ，且年龄为 50 岁及以上或至少 18 岁，患有相关合并症。 参与者提供了参加试验的书面知情同意书，并邀请一部分人参加病毒学子研究，并获得了进一步的书面知情同意书。 英国药品和保健产品监管局和健康研究局南中伯克郡研究伦理委员会批准了该试验（伦理批准参考号：21/SC/0393）。 参与者没有因参与而获得经济或其他补偿。 主要研究设计和统计分析计划的细节已在前面描述过8。

病毒学研究预先指定的主要结果是第 7 天的病毒载量，之前已报道过8。 这里报告的预先指定的次要结果是：治疗后 14 天内病毒载量的变化、治疗后 14 天内尖峰抗体浓度的变化，以及确定接受抗病毒治疗的患者中病毒基因突变是否更频繁。与普通护理相比。

病毒学子研究的参与者获得了呼吸道病毒拭子采集套件，其中包括含有液体 Virocult 培养基的 Sigma Virocult 1 ml 试管和符合欧洲体外诊断设备指令的标准尖端拭子。 该套件还包括批准用于鼻拭子和咽拭子自我采样的详细说明，以及干血点采样套件。 提供了视频教程的网络链接以帮助收集示例（https://youtu.be/klB-ckiQGz8）。

目标是招募 300 名参与者加入试验干预组 (molnupiravir) 和普通护理比较组。 基于之前发布的病毒动态模型17 号 据估计，根据 I 类错误概率设置为 0.025、功效设置为 0.9 的两样本比例测试，每组 30 名参与者可以检测到低于检测限的病毒载量的比例差异为 0.36 至 0.8。 因此，这将提供足够的能力来检测强效抗病毒药物的病毒载量差异，并且是强化采样组的样本量。 每组另外 270 名参与者进行了强度较低的病毒载量监测，目的是检测较小的病毒载量差异，并且由于基因突变在抗病毒治疗下可能不会发生，如果发生，其频率是不可预测的，总共 300 名参与者将提供 95% 的概率在 1% 或更多的参与者中看到至少一个发生突变的例子。

在密集采样队列中，参与者被要求在第 1 至 7 天和第 14 天每天收集鼻咽拭子。在非密集采样队列中，参与者在第 1、5 和 14 天收集鼻咽拭子。双臂参与者在收到采样套件后提供了第一天的基线样本，对于那些随机接受莫努匹拉韦的患者来说，采样套件与药物在同一天到达。 莫努匹拉韦组被要求在第一次服用莫努匹拉韦之前提供第一份样本。 所有样本均通过皇家邮政优先信箱发送至大奥蒙德街医院实验室，以便及时送达。 SARS-CoV-2 呈阳性的 RNA 样本随后被转移至 UCL Genomics 进行测序。 病毒学子研究的所有参与者还被要求在第 1 天、第 5 天和第 14 天提供三个手指刺破的干血斑样本。

来样加工

到达大奥蒙德街医院实验室后，VTM 中的拭子在涡旋混合器上搅拌，并将 250 µl 样品液转移到含有裂解缓冲液的无菌 Sarstedt 管中，使用 Microlab STAR 平台提取 RNA。 为了控制提取失败，在提取过程中将 PDV（海风疫热病毒）添加到每个样品中。 每批提取中均包含阴性样品提取对照。 提取后，在 Quantstudio 5 仪器上使用多重靶向一步实时 RT-PCR 对样本进行 SARS-CoV-2 和 PDV 检测。 每次 PCR 运行均包括 SARS-CoV-2 阳性模板对照和无模板对照。 记录提取和 PCR 控制结果并监测其一致性。

病毒载量

使用由已知数量的 SARS-CoV-2 RNA 十倍稀释系列生成的标准曲线确定病毒载量。 将该曲线导入 PCR 分析中，以计算每个阳性样本的病毒载量（以拷贝数/mL 为单位）。 定量下限 (LLOQ) 设置为 109 拷贝/mL，对应的 Ct 值为 40。Ct 值低于 38 的 SARS-CoV-2 阳性 RNA 样本随后被发送至 UCL Genomics 进行测序。

样品储存和培养

为了进行后续培养，将原始样品的一部分等分到含有 Gibco 牛白蛋白组分 V (7.5%) 的试管中，最终牛血清白蛋白浓度为 0.4%。 与 BSA 混合的样品在 4°C 下储存，然后在 24 小时内移至 80°C 储存。 剩余的样品单独储存在 80°C 下，以便进行潜在的重复 RNA 提取。

测序

使用 CoronaHiT 协议在 Agilent Bravo 工作站上制备文库37 使用 ARTIC v4.1 扩增子引物。 在 Illumina 测序仪上使用 2 x 75 bp 双端读数进行测序，目标深度为每个基因组 5000X。 所有运行均包括阳性和阴性对照，以检测方案每个步骤的污染。

抗体测定和 CRP 测定

如前所述处理干血点卡38。 使用商业免疫测定法（Elecsys Anti-SARS-CoV-2 S，Roche）测量洗脱物中的抗 SARS-CoV-2 刺突抗体滴度，并应用经过验证的 10 倍稀释因子校正。 CRP 浓度通过比浊法（Roche/Hitachi Cobas c）测定，不应用校正因子。 预计值比血清浓度低约 10 倍。

统计分析、建模和数据可视化

统计分析和数据可视化是在 R（版本 4.3）中进行的。 创建描述性统计数据和基线特征图（基线病毒载量和基线尖峰抗体相对于彼此和协变量）以及病毒载量、尖峰抗体和 CRP 随时间演变的图。 使用 Mann-Whitney 检验对每个时间点的病毒载量中位数进行成对比较，低于定量限的样本被替换为 LLOQ/2。

使用 R 包 nlmixr2 中的线性混合效应模型分别对 Log10 病毒载量和尖峰抗体浓度随时间进行建模。 我们原本计划使用非线性病毒动态模型，但统计分析计划最终确定后完成的后续工作表明，病毒下降同样可以使用线性模型来描述39。 使用最大似然估计来拟合所有观测值，包括那些经过审查的观测值，LLOQ 观测值的概率低于估计的量化限制（“M3 方法”）40。 采用逐步协变量分析方法，根据基线病毒载量和斜率依次测试变量（性别、症状出现后的时间、基线尖峰抗体、年龄）。 二分协变量采用比例效应进行测试，而对于连续变量，异速生长指数估计如下：pi = px (ci/ct)β，其中 pi 是个体参数，p 是总体参数，ci 是个体协变量值，ct 为总体中的中位协变量值，β 为估计的协变量效应。 附加参数的显着性通过似然比检验进行评估，模型中 ∫2 对数似然的差异呈单自由度渐近卡方分布。 如果似然比检验表明拟合度显着改善，且水平为 p<0.01，则包含协变量。 采用类似的方法来模拟尖峰抗体随时间的增加。

病毒动态模型中莫努匹拉韦的药物作用是通过病毒下降斜率的时变协变量来估计的39。 还估计了治疗结束后病毒衰退减慢的进一步影响。 最终的多变量模型用于模拟不同的治疗持续时间。 创建了 1000 名参与者的模拟数据集，其人口统计数据是从病毒学子研究人口统计数据库中抽取的。 根据每个模拟参与者的人口统计数据和参数分布的抽样，为每个模拟参与者分配模型参数。 通过连续模拟，药物效果以每日增量增加，并且病毒低于每个治疗持续时间报告的 LLOQ 的概率。 重复 1000 次以生成 95% 的预测区间。

病毒和抗体模型还用于提取每个参与者的个体参数估计值。 然后使用 Log10 病毒载量转化个体模型预测的梯形规则，使用这些数据计算第 0-14 天的曲线下面积 (AUC)，并与个体预测的尖峰抗体倍增时间进行比较。

序列分析

使用 fastp 算法对原始 fastq 读数进行调整、修剪和删除低质量读数。 将读数与 Wuuu-Hu-1 参考基因组（NC_045512.2、EPI_ISL_402125）参考序列进行比对，然后使用床文件中提供的位置修剪扩增子引物区域。 然后以至少 30 倍覆盖率调用共识序列。 原始读取到共识的整个处理是使用 nf-core/viralrecon 管道进行的41 （https://nf-co.re/viralrecon/2.6.0）。 仅保留在 10 倍测序深度下产生至少 90% 基因组覆盖率的基因组的样本进行进一步分析。 使用 iVAR 算法完成变体调用42。 映射数据还用于计算香农熵测量值，然后使用 DiversiTools 方法将其聚合为每个样本的单个分数43。

突变分析

通过减去每个参与者的额外时间点的基线突变（核苷酸）来计算基线后突变，此外，从数据集中删除了谱系特异性突变。 两个数据库，Pokay10 和 SARS2-ResistanceDB11，分别用于研究与免疫系统逃逸或莫努匹拉韦耐药性潜在相关的突变。

使用多变量线性回归来比较每个参与者的最大基线后突变负荷、转变和颠换。 模型中的协变量为：治疗组、年龄、性别、log10 基线病毒载量、log10 基线尖峰抗体以及合并症：肺、心脏、肾、肝、神经和免疫疾病、移植受者、肥胖和高血压。

系统发育分析

使用MAFFT（使用快速傅立叶变换的多重比对）算法对每个样品获得的共有序列进行多重序列比对44。 使用 IQ-TREE 根据多序列比对构建系统发育树45 使用自动模型选择和快速引导的算法。 还使用 UShER 算法将样本与全球 SARS-CoV-2 系统发育进行比较46。

病毒培养

人上皮气道 Calu-3 细胞（从 Francis Crick 获得）在 24 孔板 (Corning) 的维持培养基中生长至 50-80% 汇合，所述维持培养基由 OptiMEM (Gibco) 组成，补充有 5% FBS (Gibco)、1%青霉素/链霉素 (Thermo Fisher) 和 250 ng/ml 两性霉素 B (Invitrogen)。 然后，在 37°C 和 5% CO2 下，用 100-200 μL 残留拭子运输介质接种 1-2 小时。 然后用维持培养基替换接种物，并将细胞在 37°C 和 5% CO2 下维持 7 天。 在感染间隔（第4-5天）和终点（第7天），使用倒置相差显微镜（Olympus CK40）对所有孔进行细胞汇合和可观察到的细胞病变效应（CPE）的筛选。 通过侧流免疫层析（ACON Biotech）进一步检测疑似 CPE 孔的上清液中是否存在 SARS-CoV-2 核衣壳抗原。 当 CPE 或细胞死亡超过孔的 50% 或在感染第 7 天终点时，收集上清液并储存在 70°C 下以供进一步培养或分析。

使用多变量广义线性模型来研究与处理后样本（第 6 天及以上）中样本培养呈阳性的概率相关的协变量。 模型中的协变量为：治疗组、年龄、性别、log10 基线病毒载量和尖峰抗体，以及合并症：肺、心脏、肾、肝、神经和免疫疾病、肥胖和高血压。

培养病毒上清液的 PCR

如上所述，在使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) 提取 RNA 之前，通过添加 RNA/DNAshield (Zymo Research) 将收集的冷冻上清液解冻并灭活。 根据 SARS-CoV-2 N 基因，从每个样品中提取的 100 ng RNA 添加到 TaqMan™ Fast Virus 1-Step Master Mix 和 TaqMan™ 基因表达测定 Vi07918637_s1 (Thermo Fisher Scientific) 中。制造商的说明。 qRT-PCR 在 StepOnePlus™ 实时 PCR 系统上在 50°C 下运行 5 分钟，然后在 95°C 下运行 20 分钟，然后进行 40 个 3 分钟循环在 95°C 下，然后在 60°C 下 30°C。 StepOne™ 软件用于生成所示的 Ct 值。

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2024-02-23 09:53:39
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