实验室 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 测定的优化
寡核苷酸引物和单引导 RNA (sgRNA) 设计
根据前期研究的分子检测结果，线粒体基因组高拷贝编码的NAD1已被确定为检测O. viverrini感染的潜在靶点区域 [18, 21, 36, 37]。 此外，还可以获得来自各种寄生蠕虫的既定 DNA 序列，有助于开发专门针对 O. viverrini DNA 的引物和探针 [38]。
为了建立 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 检测，设计和开发了寡核苷酸引物和 sgRNA。 用于开发寡核苷酸引物的核苷酸序列在附加文件中提供 1：表S1A。 O. viverrini 的引物对是在特定位点手动选择的。 寡核苷酸引物和 sgRNA 分别按照 TwistDx RPA（TwistDx Limited，Maidenhead，UK）和 EnGen® Lba Cas12a（Cpf1）（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）制造商的说明进行设计。 多重序列比对揭示了寡核苷酸引物和 sgRNA 的确切位置（附加文件 2：图S1)。 用于 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 测定的寡核苷酸引物和 sgRNA 显示在附加文件中 1：表S1B。 在 Chen 等人的研究基础上使用了单链 DNA (ssDNA) 报告序列。 [39] （附加文件 1：表S1B）。 在进一步研究之前，通过使用 Primer-BLAST 对智人 (taxid: 9606)、线虫 (taxid: 6231) 和扁形动物 (taxid: 6157) 的核苷酸数据库进行爆破来确认寡核苷酸引物和 sgRNA 的特异性。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）。
为了检查提取的粪便样本 (copro-DNA) 中 DNA 的质量，使用人肌动蛋白基因 (hACTB) 作为内部对照。 使用 Primer3Plus 生成寡核苷酸引物（https://www.primer3plus.com）遵循制造商的说明（TwistDx RPA）。 为了测试提取的粪便样本中是否存在任何抑制因子，将含有刺颌口吸虫羧肽酶 C2 基因 (pET20b+–GsCPC2) DNA 模板的 pET20b+ 载体同样掺入粪便 DNA 样本中进行 RPA。 开发的 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 检测仅限于检测到 hACTB 和 GsCPC2 扩增子的样本。 本研究中使用的所有寡核苷酸引物均列于附加文件中 1：表S1B。
O. viverrini 和其他蠕虫的基因组 DNA 控制
为了评估 RPA 寡核苷酸引物的特异性，我们使用了除 O. viverrini 之外的蠕虫基因组 DNA，包括蛔虫、鞭虫、美洲钩虫、太冲单吸虫、华支睾吸虫和巨片形吸虫，这些都存在于胃肠道中和肝胆管——作为 Ov-RPA-CRISPR/Cas12a 测定的 DNA 模板。 我们使用组织基因组 DNA 迷你试剂盒（新北市 Geneaid Biotech Ltd.）提取 A. lumbricoides、T. trichiura、N. americanus、H. taichui、C. sinensis、F. gigantica 和 O. viverrini 成虫的 DNA ，台湾）遵循制造商的说明。 我们使用 NanoDrop（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）和 1% 琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 样品的质量和数量。
含有 O. viverrini NAD1 基因 (pGEMT-OvNAD1) 的质粒用作 Ov-RPA-CRISPR/Cas12a 测定的阳性对照。 我们按照制造商的说明（Promega Corporation，麦迪逊，威斯康星州，美国）构建了 pGEMT–OvNAD1 质粒。 简而言之，我们使用 O. viverrini DNA 作为模板，通过 Taq DNA 聚合酶 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) 扩增 NAD1 扩增子。 随后，将扩增子连接至pGEM-T Easy载体，然后转化至大肠杆菌菌株JM109。 从细菌中分离出 pGEMT-OvNAD1 质粒，用于后续实验。
Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 测定中寡核苷酸引物和 sgRNA 的特异性
为了评估特异性，使用 O. viverrini、A. lumbricoides、T. trichiura、N. americanus、H. taichui、C. sinensis 和 F. gigantica 的 gDNA (10 ng) 作为 RPA 的 DNA 模板。 RPA 产品随后被用作 CRISPR/Cas12a 检测的 DNA 模板。 所有样品一式三份进行分析。 RPA 使用 TwistAmp™ 基本套件（TwistDx Limited，Maidenhead，英国）按照制造商的说明进行。 简而言之，制备 50 μL 反应混合物，其中含有 2.4 μL 10 μM 正向和反向引物（各）、29.5 μL 无引物补液缓冲液、10 ng DNA 模板（在 Milli-L 中调整至体积为 13.2 μL）。 Q 水和 2.5 μL 280 mM 醋酸镁 (MgOAc)。 每组反应均纳入阴性（无模板对照）和阳性（O. viverrini DNA）对照。 将反应混合物在 T100 热循环仪（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA）中于 40°C 孵育 20 分钟。 孵育 4 分钟后，将管从循环仪中取出，涡旋，然后短暂旋转，然后返回到 40°C。 总的来说，每种未纯化的反应混合物各 2 µL 作为 CRISPR/Cas12a 检测的模板。 使用 GenepHlow™PCR Cleanup Kit (Geneaid Biotech Ltd) 纯化剩余的反应混合物，并进行琼脂糖凝胶电泳以确认目标 (281 bp) 的成功扩增。
为了进行 CRISPR/Cas12a 测定，30 μL 反应混合物含有 3 μL NEBuffer 2.1（100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2 和 1 mM DTT；pH 7.9）、1 μL 1 μM sgRNA，添加 1 μL Lba Cas12a (NEB) 和不含 RNAse 的水，使体积达到 27 μL。 然后使用 T100 热循环仪（Bio-Rad Laboratories）将反应混合物在 25°C 下孵育 10 分钟以生成 Cas12a-sgRNA 复合物。 随后，将 1 μL 10 μM ssDNA 报告基因和 2 μL RPA 产品添加到反应混合物中。 然后将反应混合物在 37°C 下孵育 20 分钟，然后在 65°C 下孵育 10 分钟以终止反应。 从阴性和阳性对照 DNA 扩增的 RPA 产物分别用作 CRISPR/Cas12a 检测中阴性和阳性对照的模板。 使用 CFX96 实时 PCR 系统（Bio-Rad Laboratories）在终点测量荧光值（相对荧光单位，RFU）。 此外，使用紫外透照仪对成品反应管进行目视检查，并使用手机摄像头拍照。
Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 检测的检测限
为了确定 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 检测的检测限，将 O. viverrini DNA 十倍连续稀释液 (10 ng–10−5 ng) 添加到从健康人类粪便样本中获得的 100 ng 粪便 DNA 中。 反应混合物（50 μL）含有 2.4 μL 10 μM 正向和反向引物（各）、29.5 μL 无引物补液缓冲液、100 ng copro-DNA（含有 10–10−5 ng O. viverrini DNA），调整至13.2 μL 的 Milli-Q 水和 2.5 μL 280 mM MgOAc。 将反应混合物在 40°C 下孵育 20 分钟。 随后，各2 μL未纯化的反应混合物用作CRISPR/Cas12a检测的模板。 为了进行 CRISPR/Cas12a 测定，添加 30 μL 反应混合物，其中含有 3 μL NEBuffer 2.1、1 μL 1 μM sgRNA、1 μL Lba Cas12a (NEB) 和无 RNAse 水，使体积达到 27微升。 然后将反应混合物在 25°C 下孵育 10 分钟。 随后，将 1 μL 10 μM ssDNA 报告基因和 2 μL RPA 产品添加到反应混合物中。 然后将反应混合物在 37°C 下孵育 20 分钟，然后在 65°C 下孵育 10 分钟以终止反应。 所有样品一式三份进行分析。
确定最佳截止值
根据实时 PCR 系统获得的荧光值确定最佳截止值。 我们对档案标本进行了 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 检测，包括 O. viverrini 阳性 (n = 4) 和 H. taichui 阳性 (n = 10) 粪便样本，这些样本是通过 KK 检查检测到的。 这些感染的粪便标本还通过对驱虫获得的成虫进行形态学鉴定来确认感染的种类。 此外，其他蠕虫阳性粪便样本，包括线虫、毛虫、钩虫和绦虫属。 （每个物种，n = 3）以及阴性粪便样本（n = 10）在该测定中用作对照。
为了从粪便样本中提取 DNA，将保存在 80% (v/v) 乙醇中的大约 200 mg 粪便转移到新的微量离心管中，并用 Milli-Q 无菌水洗涤三次以除去乙醇。 为了破坏蠕虫卵，将沉积物快速冷冻在液氮中，并使用 TissueLyser LT（Qiagen，希尔登，德国）和不锈钢珠（5 mm）（Qiagen）裂解。 按照制造商的说明，通过 QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen) 从沉积物中提取 DNA。 DNA 在 50 μL ATE 缓冲液中洗脱。 使用 NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc.) 和 1% 琼脂糖凝胶电泳测定 DNA 的质量和数量。 所有 DNA 样本均储存于 -20 °C，然后在先前描述的条件下用于 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 测定。 阴性copro-DNA（阴性粪便样本）和pGEMT-OvNAD1分别作为阴性和阳性对照纳入每组反应中。
在用于 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 测定之前，为了评估 DNA 质量，所有 DNA 样本均经过 RPA，针对内部对照 hACTB。 hACTB 的 RPA 条件与前面提到的相同，除了使用 hACTB 的特异性引物（附加文件 1：表S1B）。 使用 1% 凝胶电泳评估目标扩增子。 为了测试 copro-DNA 样品中是否存在任何抑制因子，将 pET20b+–GsCPC2 添加到每个 RPA 反应混合物中。 简而言之，50 μL 反应混合物含有 2.4 μL 10 μM 正向和反向引物（各），对 GsCPC2 具有特异性（附加文件 1：表 S1B)、29.5 μL 无引物补液缓冲液、2 μL pET20b+–GsCPC2 和 2 μL copro-DNA 样品（在 Milli-Q 水中调整至 13.2 μL 体积），以及 2.5 μL 280 mM MgOAc。 将反应混合物在 T100 热循环仪（Bio-Rad Laboratories）中于 40°C 孵育 20 分钟。 采用凝胶电泳 (1%) 来评估 GsCPC2 扩增子。 当 DNA 扩增子长度为 378 bp 时，样品被认为不受抑制。
构建受试者工作特征 (ROC) 曲线来比较 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 检测与 KK 方法的诊断性能。 使用 easyROC v.1.3.1 计算最佳截止值（http://biosoft.erciyes.edu.tr/app/easyROC/）。 P 值 < 0.05 被认为表明有统计学意义。 使用 Delong 等人描述的方法估计曲线下面积 (AUC) 的标准误差。 [40]。
使用现场收集的粪便样本验证 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 测定
研究区
研究地点位于沙功那空府 Mueang Sakon Nakhon 区 Ban Nongplanoi（图 1）。 1）。
泰国地图显示了现场地点的位置。 具体野外采集地点已在放大图中标出
道德批准并同意参与
这项研究得到了泰国曼谷玛希隆大学热带医学学院人类研究伦理委员会的批准（MUTM 2022-049-01）。 所有参与者都获得了书面知情同意书。 粪便检查结果已报告给目标地区的健康促进医院，以便当地医生或卫生官员按照泰国公共卫生部疾病控制司提供的治疗指南采取进一步行动 [41]。
粪便样本采集
健康志愿者将贴有标签的样品杯分发给研究参与者。 第二天，样本要么由健康志愿者收集，要么由参与者提交到收集点。 在收集粪便样本的同时，还记录了患者的年龄、性别和地理位置信息。 KK 和 FECT 分析在现场进行。 为了进行 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 测定，将平行粪便样本（约 200 mg）储存在含有 80% (v/v) 乙醇的 2 mL 微量离心管中，以便在室温下运输至学院蠕虫学系曼谷热带医学学院。
所有人类粪便样本均使用 KK 方法进行检查。 简而言之，使用不锈钢筛子压制各个粪便样本，并使用 39.2 毫克非保留材料填充试剂盒模板。 样本上覆盖有甘油-孔雀石绿浸泡过的玻璃纸，并用力按压，使粪便散布在整个表面。 30 分钟后，使用光学显微镜检查整个载玻片是否存在 O. viverrini 样卵和其他蠕虫。 每个粪便样本由不同的检查人员重复检查，每克粪便中的虫卵数量 (EPG) 是通过将虫卵计数乘以 25.5 计算得出的。 所有样本均已匿名。
与 KK 方法并行，进行了 FECT。 简而言之，将2g粪便样本与10mL 0.85%生理盐水溶液混合，通过两层湿纱布沥干，并收集在15mL离心管中。 随后，将样品以3000rpm离心5分钟，弃去上清液。 向离心管中加入 10 mL 10% 福尔马林，加入 3 mL 乙酸乙酯，剧烈振荡，3000 rpm 离心 5 min。 除去上面三层后，保留含有1mL 10%福尔马林的沉淀物。 使用光学显微镜检查最终的悬浮液中是否存在类似 O. viverrini 的卵和其他蠕虫。
Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 检测
所有用乙醇保存的现场粪便样本均用 Milli-Q 无菌水洗涤三次，并按照先前所述进行破碎，然后使用 QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen) 提取 DNA。 使用 NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc.) 和 1% 琼脂糖凝胶电泳测定 DNA 的质量和数量。
总体而言，每个 DNA 样本 100 ng 作为 RPA 的模板。 RPA 和 CRISPR/Cas12a 检测的反应混合物和程序先前已描述。 每组反应中均包含阴性copro-DNA（阴性粪便样本）和pGEMT-OvNAD1，分别作为阴性和阳性对照。
使用CFX96实时PCR系统(Bio-Rad Laboratories, Inc.)测量终点处的荧光值进行检测。 终点荧光值高于截断值的样品被认为是 O. viverrini 感染阳性，而低于截断值的样品被认为是阴性结果。 在进行 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 测定之前，在所有靶向 hACTB 和 GsCPC2 的 DNA 样本中进行了 RPA。 此外，使用 UV 透照仪对成品反应管进行目视检查，并使用手机摄像头和/或 Gel Doc XR + Gel 文档系统（Bio-Rad Laboratories, Inc.）拍照。
统计分析
Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 测定的灵敏度和特异性是通过使用 MedCalc 诊断测试评估计算器 v22.005 与标准方法（KK 和/或 FECT）进行比较来确定的（https://www.medcalc.org/calc/diagnostic_test.php）。
使用 easyROC v1.3.1 构建 ROC 曲线（http://biosoft.erciyes.edu.tr/app/easyROC/）将 Ov-RPA–CRISPR/Cas12a 检测与标准方法的诊断性能进行比较。 P 值 < 0.05 被认为表明有统计学意义 [40]。
2024-02-21 13:44:07
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