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作者单位：肯尼亚内罗毕内罗毕大学（BM Ogoti、V Riitho、N Mutono、J Oyugi、M Mureithi、SM Thumbi）； 伦敦玛丽女王大学，英国伦敦（V. Voice）； 德国柏林慈善大学医学院（J. Wildemann、J. Tesch、J. Rodon、K. Harichandran、J. Emanuel、E. Moncke-Buchner、VM Corman、C. Drosten、MA Müller）； 华盛顿州立大学，普尔曼，华盛顿，美国（N. Small，SM Thumbi）； 粮食及农业组织，坦桑尼亚达累斯萨拉姆（S. Kiambi）； 柏林劳工生活慈善有限公司，柏林 (VM Corman)； 德国感染研究中心，柏林（VM Corman、C. Drosten、MA Müller）； 爱丁堡大学，英国苏格兰爱丁堡 (SM Thumbi)
中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）在阿拉伯半岛和非洲的单峰骆驼中流行； 血清阳性率>75%（1–3）。 人畜共患病向人类传播的情况时有发生，主要发生在阿拉伯半岛； 已发生超过 2,400 例 MERS 病例和超过 800 例死亡（4）。 尽管肯尼亚是一个主要的骆驼养殖国，但 2019 年仅发现了 3 名潜在的本地骆驼暴露者，患有亚临床 MERS-CoV 感染（5）。 明显的区域流行病学差异可能与诊断有限、当地危险因素（例如人类合并症、骆驼放牧方式、季节性）或中东呼吸综合征冠状病毒毒株特异性特征等因素有关。6）。
在养殖的单峰骆驼中，中东呼吸综合征冠状病毒的爆发与每年同步的骆驼分娩有关。7）。 特别是，小骆驼在出生后 4-6 个月失去母体抗体后，检测出 MERS-CoV RNA 呈阳性。 由于季节性和食物供应的变化，非洲的大多数骆驼都是游牧的，种群密度也存在差异。 肯尼亚骆驼的高人口密度与中东呼吸综合征冠状病毒血清阳性相关（1），但缺少对 MERS-CoV 循环的详细了解。
对游牧骆驼的实地研究因偏远和资源有限地区基础设施有限而受到阻碍（8）。 然而，游牧骆驼定期被运送到屠宰场中心，以实现持续的日常检测。 我们在肯尼亚北部的一个屠宰场中心进行了一项连续 12 个月的研究，以调查游牧骆驼中 MERS-CoV 的发病率，并探索向屠宰场工人传播的可能性。
图1
图1。 2022-2023 年肯尼亚北部屠宰场中心采样的单峰骆驼中双相中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV) 的发病率。 A) 单峰骆驼鼻拭子样本中的 MERS-CoV RNA 检出率……
我们的采样点是肯尼亚北部伊西奥洛的一个屠宰场中心，来自马萨比特、桑布鲁和伊西奥洛县的骆驼在这里被屠宰（附录 图1）。 2022 年 9 月至 2023 年 9 月期间，我们每周 4-5 天从 10-15 头单峰骆驼身上采集样本（附录）。 这些骆驼（n = 2,711）最初来自12个不同的行政区，主要来自马萨比特县的莱萨米斯（n = 1,841，67.9%）和伊西奥洛县的布拉特（n = 578，21.3%）（桌子; 附录 图1）。 在 36/2,711 例 (1.3%) 中检测到 MERS-CoV RNA（桌子; 图1）骆驼使用定量逆转录PCR，扩增包膜E基因的上游，并通过开放阅读框（ORF）1ab定量逆转录PCR或测序进行确认（附录）。 2022年9月至10月的累积RNA阳性率较高，为19/381（5.0%），而2023年1月至3月为17/727（2.3%）（图1）。 发病率呈双相，显示检测峰值出现在 2022 年 10 月的前几周（7/60，11.7%）和 2023 年 2 月（7/58，12.1%）（图1面板 B）。 对于 9/36 MERS-CoV 阳性样本，我们获得了 ORF1ab 序列并进行了系统发育分析。 9 个 ORF1ab 序列高度相似（>99.93% 核苷酸同一性），与 2019 年在埃塞俄比亚阿卡基发现的最接近的 MERS-CoV 亲属具有 99.75%–99.78% 核苷酸同一性（9）。 系统发育分析表明，这 9 个序列在进化支 C2.2 中聚集为一个单系群，其中包括 2018 年最初在肯尼亚发现的东非菌株（10) (附录 图 2）。 这些序列代表了肯尼亚骆驼中同时发生的 3 次假定的 MERS-CoV 爆发（附录 表格1）。
为了测试双相 MERS-CoV RNA 阳性是否伴随着 MERS-CoV IgG 水平升高，我们通过 MERS-CoV S1 ELISA 测试了随机骆驼血清样本 (n = 369/2,711)。附录）。 MERS-CoV IgG 水平显示中位光密度比 (ODR) 为 2.14 (95% CI 0.59–3.48)，血清阳性率为 80.76% (298/369)（附录 图 3，面板 A)。 6 月份的 IgG 水平最低（中位 ODR 1.28，95% CI 0.20–3.31），而 3 月份的水平最高（中位 ODR 2.72，95% CI 1.67–3.76）。 MERS-CoV IgG 水平与 RNA 阳性呈负相关（ODR 0.20，95% CI 0.09–0.44；p<0.0001）（附录 图 3，图 B)。 RNA 阳性与季节呈负相关（干燥与潮湿，ODR 0.14，95% CI 0.06–0.30；p<0.0001). Male camels were more likely to be RNA positive (ODR 3.94, 95% CI 0.86–29.2; p = 0.11) and less likely to be seropositive (ODR 0.27, 95% CI 0.08–0.77; p = 0.021) than were female camels. Older animals (>3岁以下的动物比3岁以下的动物（72%）更有可能出现血清反应阳性（86%），但这种差异没有统计学意义。
图2
图2。 肯尼亚伊西奥洛，接触过骆驼的屠宰场工人的中东呼吸综合征冠状病毒免疫反应。 A) 商业 MERS-CoV S1 蛋白 ELISA 检测 Isiolo 屠宰场 48 份血清样本（1:100 稀释）中 IgG 反应的结果…
血清流行病学研究表明，与单峰骆驼接触的屠宰场工人接触 MERS-CoV 的风险增加（11）。 当应用商业试剂盒诊断实施的 ELISA 截止值（例如，对于 IgG 阳性，ODR = 1.1）时，可能会错过亚临床 MERS 病例的血清转化（11,12）。 我们在 7/48 (14.6%) 的 Isiolo 屠宰场工人中发现了 MERS-CoV S1 IgG 反应性 (ODR >0.2)（图2面板A）。 通过比较基于 MERS-CoV S1 的 ELISA ODR 与基于 SARS-CoV-2 S1 的 ELISA，我们排除了 SARS-CoV-2 感染或疫苗诱导的抗体与 MERS-CoV S1 的交叉反应。附录 表2、图4）。 没有骆驼暴露史的对照队列 (n = 12) 尽管 SARS-CoV-2 S1 IgG 水平较高 (11/12; 92%)，但没有表现出 MERS-CoV S1 IgG 反应性 (0/12; 0%)。附录 表 2）。
基于携带来自进化枝 A EMC/2012 或进化枝 C2.2（肯尼亚）的 MERS-CoV S 蛋白的 GFP 编码水泡性口炎病毒假颗粒 (VSVpp) 的中和试验 (NT) 显示，1/7 血清样本（1:20 稀释） ）在 EMC/2012 中，VSVpp-NT 的病灶形成单位减少了 50%，在肯尼亚 VSVpp-S 中，病灶形成单位减少了 90%（图2面板 B）。 基于 MERS-CoV EMC/2012 的噬菌斑减少中和试验 (PRNT) 显示 1:20 稀释度的 PRNT 为 50%，符合世界卫生组织确认 MERS-CoV 血清转化的标准。 6 项均未选择 MERS-CoV S1 ELISA–通过 VSVpp-NT 和 PRNT 测试时，阴性屠宰场样品显示出中和能力（附录 表 2）。
我们对单峰骆驼的持续采样显示，肯尼亚北部存在双相 MERS-CoV 发病率，这在之前的研究中未观察到（1,10,13）。 一种解释可能是感染中东呼吸综合征冠状病毒的单峰骆驼的病毒排泄时间较短（14），如果没有日常监测，病毒 RNA 检测就会变得困难。 系统发育分析表明，我们在 3 个不同的周内在来自不同病房的单峰骆驼中发现了 > 3 个 MERS-CoV 簇。 可能影响疫情爆发的第一个潜在因素是动物间相互作用的增加，因为来自不同畜群的骆驼被运送到伊西奥洛并在屠宰前放在一起圈养，这可能会加剧中东呼吸综合征冠状病毒的爆发。 其次，在运输过程中和在围栏中，未免疫动物和受感染动物之间的相互作用增加，增加了传播中东呼吸综合征冠状病毒的可能性。 IgG 阴性成年骆驼的高比例（19.24%，ODR<0.3）支持了这一假设（1,7）。 尽管确定骆驼之间确切的中东呼吸综合征冠状病毒传播情况在逻辑上很困难，但即使在资源有限的条件下，快速的护理点测试也可能有助于追踪感染。
双相中东呼吸综合征冠状病毒的总体发病率可能与季节性因素有关，例如肯尼亚北部每年两次的干湿季交替。 在旱季，牛群聚集在一起，使用有限的草料，然后在雨季迁移回出发地。 由于犊牛主要在两个雨季出生，母源抗体失去保护的时间恰逢旱季。 值得注意的是，2022 年 7 月至 10 月和 2023 年 1 月至 2 月的两个旱季与 2022 年 10 月和 2023 年 2 月的 MERS-CoV RNA 阳性峰值相匹配。人口密度的增加和有限水坑接触概率的增加可能会促进中东呼吸综合征冠状病毒在骆驼之间的感染和传播。
我们通过实施 ELISA ODR 截止值，确定了 7/48 名屠宰场工人，其中 7/48 名疑似曾接触过 MERS-CoV 或既往亚临床感染，此前已证明该值适用于临床环境之外的血清流行病学研究。 在 1/7 的病例中，我们通过基于 VSVpp 的 NT 和 PRNT 确认了 MERS-CoV 中和抗体。 近年来，没有屠宰场工人出现严重症状，这支持了 C 分支菌株的致病性和传播性可能有限的假设。15）。 确定导致中东呼吸综合征冠状病毒爆发的明确因素将有助于预测流行病学、风险评估以及及时对公共和职业健康采取预防性干预措施。
Ogoti 博士是肯尼亚内罗毕大学 CEMA、UNITID 的病毒学家。 他的研究兴趣包括高致病性冠状病毒的流行病学和特征。
我们感谢 Patrick Muthui 提供的出色技术援助，感谢 Muema Mulei 对启动屠宰场研究的支持，感谢 Triza Shigoli、Noel Likalamu 和 Andrea Sieberg 提供的后勤和行政援助。 我们感谢 Gert Zimmer 提供 VSVpp 系统。 我们感谢所有骆驼主人和屠宰场工人在肯尼亚采集样本期间提供的帮助。 我们感谢位于德国里姆斯岛 Friedrich Löffler 研究所的德国 FMD 参考中心在进口前对样品进行测试。
这项工作由德国研究基金会资助（DFG 向 SMT 和 MAM 拨款 MU3564/3-1）。 CD 获得了德国感染研究中心 (DZIF) 和欧盟 ERA-Net 耐用项目（GA 号 101102733）的基础设施支持。 资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。
MAM 和 VMC 以有关 SARS-CoV-2 血清学检测和单克隆抗体的专利命名。
2024-02-14 17:12:16
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