RNA 结合蛋白 TDP-43 在细胞质中的异常积累及其从细胞核中的消耗是多种神经退行性疾病的病理标志，包括额颞叶变性 (FTLD-TDP)、肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和阿尔茨海默病 (AD-贸易发展计划）。 细胞核中 TDP-43 的丢失会损害其在 RNA 剪接过程中抑制隐秘外显子 (CE) 包含的能力 [1]。 因此，CE 异常地包含在 STMN2 和 UNC13A 等关键转录本中 [2,3,4,5,6,7,8,9]它会产生截短或不稳定的 RNA 并导致其功能丧失。 最近，我们和其他人证明，一些具有框内 CE 的转录物产生稳定的含有 CE 的新型蛋白质，可在 FTLD-TDP 或 ALS 患者的脑脊液 (CSF) 中检测到 [10, 11]。 一个值得注意的例子是源自肝癌源性生长因子样蛋白 2 (HDGFL2-CE) 基因的一种神秘蛋白，这是一种在整个大脑中表达的组蛋白结合蛋白。 因此，CSF HDGFL2-CE 有可能作为 TDP-43 病理学的敏感生物标志物，阐明病理性 TDP-43 对 TDP-43 蛋白病临床变异的贡献 [11]。 但由于缺乏测量生物体液中病理性 TDP-43 的可靠方法，测试 CSF HDGFL2-CE 是否指示 TDP-43 病理学受到阻碍。 为了确定 HDGFL2-CE 丰度是否可以用作 TDP-43 病理存在的读数，我们在一组经过充分表征的死后研究中探讨了 HDGFL2-CE 是否优先在患有 TDP-43 蛋白病的受影响神经解剖区域中表达。 FTLD-TDP 和 AD-TDP 病例的组织，以及 HDGFL2-CE 丰度是否与病理性 TDP-43 负担相关。
基于HDGFL2-CE蛋白的预测结构（图S1A)，我们已经生成了先前描述的兔多克隆 HDGFL2-CE 抗体 (Mayo-LP) [10] 特异性检测 TDP-43 耗尽的人诱导多能干细胞 (iPSC) 裂解液中的 HDGFL2-CE，但不能检测野生型 HDGFL2 (HDGFL2-WT) 蛋白（图 S）1B）。 使用商业 C 端 HDGFL2-WT 抗体作为捕获抗体，并使用我们的 Mayo-LP HDGFL2-CE 抗体作为检测抗体，我们开发了 Meso Scale Discovery (MSD) 免疫测定法，可剂量依赖性检测内源 HDGFL2-CE 蛋白500-8000 ng 来自 TDP-43 耗尽的 iPSC 衍生神经元的总蛋白裂解物 [10]。 此后，我们通过生物素化捕获抗体、使用链霉亲和素 MSD 板并测试不同的稀释剂进一步优化了测定（图 S）1C-E）。 当使用 MSD Diluent 35 时，我们改进的检测方法在过表达这些蛋白的 HEK293T 细胞裂解液中的 16 ng 总蛋白中检测到 HDGFL2-CE，但未检测到 HDGFL2-WT（图 S）1D）。 为了确定我们的测定是否足够灵敏以检测内源性 HDGFL2-CE，我们使用了对照和 TDP-43 耗尽的 iPSC 的裂解物。 与 Diluent 35 相比，Diluent 100 提供了更好的信噪比，可检测来自 TDP-43 耗尽的 iPSC 裂解物中低至 125 ng 总蛋白的内源 HDGFL2-CE（图 S）1E）。
接下来，我们测试了我们的优化测定是否可以检测以 TDP-43 病理学为特征的 FTLD-TDP（杏仁核和额叶皮层）和 AD-TDP（杏仁核）大脑区域中的 HDGFL2-CE [7]。 与认知正常对照（对照）相比，在未经调整的分析以及调整死亡年龄和性别时，FTLD-TDP和AD-TDP病例杏仁核中的HDGFL2-CE显着增加（图1）。 1A、表S1）。 相反，与对照组相比，仅在 FTLD-TDP 病例中，额叶皮层 HDGFL2-CE 显着增加（图 2）。 1B、表S1）。 当比较没有 TDP-43 病理学的 AD 病例（AD 无 TDP）与 AD-TDP 病例时，AD-TDP 中杏仁核中的 HDGFL2-CE 显着增加，但额叶皮质中没有显着增加（图 1）。 1A、表S1) – 鉴于 AD-TDP 病例额叶皮质中 TDP-43 病理学的缺乏，这是预期的结果。
FTLD-TDP 和 AD-TDP 中具有 TDP-43 病理学的大脑区域中 HDGFL2-CE 蛋白增加，并将这些 TDP-43 蛋白病与非 TDP-43 对照区分开来。 认知正常对照（Ctrl，n = 27，n = 26 杏仁核和 n = 25 额叶皮质）杏仁核 (A) 和额叶皮质 (B) 中 HDGFL2-CE 蛋白的免疫测定定量，FTLD-TDP (n = 67) 、AD-TDP (n = 70) 和 AD 无 TDP (n = 27)。 数据表示为平均值±sem * P < 0.05 和**** P < 0.0001，ns：不显着。 (C、D) 接收者操作特征曲线 (AUC) 下的面积显示杏仁核或额叶皮层中 HDGFL2-CE 区分 FTLD-TDP 与 Ctrl（粉色）、AD-TDP 与 Ctrl（金色）的辨别能力，以及AD-TDP 来自 AD 无 TDP（黑色）。 显示 AUC 值。 (E–G) FTLD-TDP 患者杏仁核 (E) 和额叶皮层 (F) 以及 AD-TDP 患者杏仁核 (G) 中 HDGFL2-CE 蛋白和 RNA 丰度与 pTDP-43 丰度的散点图）。 显示了根据年龄和性别调整后的 pTDP-43 与 HDGFL2-CE 蛋白和 RNA 的线性回归分析的回归系数 (β) 和 P 值
HDGFL2-CE 的存在区分了杏仁核中患有和不患有 TDP-43 病理的个体：HDGFL2-CE 区分了对照组和患有 TDP-43 病理的个体，AD 的受试者工作特征曲线 (AUC) 下面积分别为 0.85 和 0.92 -TDP和FTLD-TDP，分别表明良好至优秀的辨别能力（图2）。 1C）。 当评估杏仁核 HDGFL2-CE 蛋白是否区分 AD no TDP 和 AD-TDP 时，我们发现具有中等的辨别能力（AUC 为 0.68，图 1）。 1C）。 在额叶皮质中，HDGFL2-CE 区分对照和 FTLD-TDP，AUC 为 0.82，表明具有良好的辨别能力（图 2）。 1D）。
最后，在未经调整的分析和调整死亡年龄、性别、和RNA完整性数（RIN），后者仅用于HDGFL2-CE RNA的分析（图1）。 1E、F、表S2）。 在 AD-TDP 病例的杏仁核中，在未调整和调整分析中，pTDP-43 负荷也与 HDGFL2-CE 蛋白和 RNA 相关（图 2）。 1G、表S2）。 然而，HDGFL2-CE 蛋白的估计 β 系数高于 HDGFL2-CE RNA，表明 HDGFL2-CE 蛋白可作为 TDP-43 功能障碍的更准确指标。
FTLD-TDP、ALS 和 AD-TDP 中充分记录了由于 TDP-43 功能障碍导致 mRNA 中 CE 的保留 [2,3,4,5,6,7,8]但某些框内 CE 产生稳定的神秘蛋白质的鉴定是新的 [8, 10, 11]。 在这里，我们探索了最近发现的 HDGFL2-CE 蛋白。 通过开发敏感且特异的免疫测定法来检测 HDGFL2-CE 蛋白，我们观察到 HDGFL2-CE 在 FTLD-TDP 和 AD-TDP 中具有 TDP-43 病理学的大脑区域显着增加，与 pTDP-43 负荷相关，并且可以区分具有 TDP-43 病理学的个体与不具有 TDP-43 病理学的个体。 根据我们的发现，欧文等人。 使用他们的 HDGFL2-CE 抗体对 ALS-FTD 患者的运动皮层和海马组织进行免疫荧光染色，证明 HDGFL2-CE 蛋白在表现出 pTDP-43 病理的细胞中积累 [11]。 他们还发现，与对照组相比，可能患有 TDP-43 病理学的个体（即症状前或症状性 C9orf72 重复扩增携带者和散发性 ALS 患者）的 CSF HDGFL2-CE 在统计学上显着较高 [11]。
总的来说，这些发现表明大脑中 HDGFL2-CE 的存在是神经退行性疾病中 TDP-43 病理学的敏感报告者。 这些发现使 CSF HDGFL2-CE 成为 TDP-43 病理学和功能障碍的替代标志物，这反过来又将为基于 TDP-43 的潜在疗法的临床试验选择理想参与者提供信息，并有可能为病理亚型制定精准医疗策略FTLD 和 AD。
2024-03-27 11:31:45
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